荧光定量PCR技术在α地中海贫血基因筛查与诊断中的研究.docVIP

精品论文 参考文献 荧光定量PCR技术在α地中海贫血基因筛查与诊断中的研究 广西钦州市灵山县人民医院，广西灵山 535400, 　　摘要：目的：分析探讨荧光定量PCR技术在alpha;地中海贫血基因筛查与诊断中的实际应用。方法：选择2014年1月-2014年12月之间来我院进行alpha;地中海贫血基因筛查诊断的800例孕妇作为观察对象，使用荧光定量PCR技术进行筛查。对其中得到的阳性标本使用传统基因诊断方式测定；同时通过血红蛋白电泳法筛查800例孕妇是否存在alpha;地中海贫血。结果：800例孕妇中有13例为alpha;地中海贫血基因携带者，检出率为1.63%；这13例的基因分型分别为：13例为缺失型、0例为突变型；应用传统经检测方法对孕妇进行筛查，得到与荧光定量PCR技术相同的结果；应用血红蛋白毛细管电泳技术得到的alpha;地中海贫血孕妇有4例，检出率为0.5%。结论：应用荧光定量PCR技术对育龄期的孕妇进行alpha;地中海贫血筛查的结果可靠，对于预防缺陷新生儿的出生具有非常重要的意义。 　　关键词：荧光定量PCR技术；alpha;地中海贫血；基因筛查；血红蛋白 　　alpha;地中海贫血是临床中较为多见的常染色体隐性遗传疾病，发病原因主要是由于编码alpha;珠蛋白中alpha;基因缺失【2】，我国南方属于该病的高发区域，尤其是广东、广西地区alpha;地中海贫血的人群携带率有近10%。当前，对于alpha;地中海贫血尚没有有效的治疗方法，科学有效的产前检查是预防该病的主要措施。临床中通过血常规筛查对疾病进行检测，对平均红细胞体积（MCV）与平均血红蛋白含量（MCH）降低的患者进行基因检测，但是该方法对于静止型患者的缺陷不能够很好的检测，容易漏诊。荧光定量PCR技术对于缺失型alpha;地中海贫血基因检测具有较好的敏感性和特异性，其对于仪器的要求不高且操作较为便捷，当前应经广泛的应用在地中海贫血基因的检测中【2】。本文应用荧光定量PCR技术对800例孕妇进行筛查和诊断，现将结果总结如下。 　　1 资料与方法 　　1.1一般资料 　　选择2014年1月-2014年12月之间来我院进行alpha;地中海贫血基因筛查诊断的800例孕妇作为观察对象，孕妇中年龄最小的为20岁、最大的为41岁，平均（26.52plusmn;3.08）岁；孕周最小为9周、最大为15周，平均（12.43plusmn;1.12）周。抽取孕妇的静脉血进行抗凝处理，交由医院实验室处理。全部800例孕妇在试验之前均得到通知，且自愿产于本次研究。应用“多色荧光PCR熔解曲线技术”进行检验，血红蛋白电泳使用德国进口的全自动毛细管电泳仪，仪器的配套试剂。 　　1.2方法 　　1.2.1DNA的提取：DNA提取应用常规的苯酚-氯仿抽提法，然后经过37℃持续10min的干燥处理，加入30-150mu;l的去离子水，储存在4℃的恒温箱中待测，在7天之内实施基因扩增处理； 　　1.2.2荧光定量PCR技术方法：首先进行UNG酶处理，设定好50℃持续2min，1个循环；预变性设置95℃持续10min，同样1个循环；随后是降落循环程序，首先95℃持续30s、然后65℃持续30s，最后是76℃持续45s，设定10个循环；PCR循环程序为：95℃持续30s、继续60℃持续30s，最后是76℃持续45s，设定有50个循环；最后是熔解曲线的分析程序：95℃持续1min、继续35℃持续3min，最后是45-85℃之间，每一个0.4℃采集通道荧光信号，1个循环。 　　1.2.3gap-PCR方法：应用gap-PCR方法对常见的三种alpha;-珠蛋白基因缺失型进行检测，分别为-alpha;4.2、-alpha;3.7以及-SEA。应用前文中提取的DNA溶液，以1mu;l作为模板，其中含有100ng的DNA，并将其加入到扩增反应体系中，设置95℃进行15min的预处理，然后为98℃持续45s、64℃持续75s以及72℃持续150s，共设定有35个循环，最后将72℃延长5min，以实现对PCR的扩增处理。 　　1.2.4电泳检测：将10mu;l的PCR扩增产物加入到2mu;l的溴酚蓝上样缓冲液中，使用浓度为1.0%的琼脂糖凝胶电泳进行30min的处理，在凝胶成像仪中可观测结果。结果的判定标准为：alpha;-珠蛋白正常基因的扩增产物应当是长度为1.8kb的条带状物体；alpha;-珠蛋白基因中-alpha;4.2缺失型的条带产物长度为1.6kb；-alpha;3.7缺失型的条带状产物长度为2.0kb；-SEA趋势性扩增产物的长度为1.3kb。 　　1.2.5血红蛋白电泳技术：选择德国进口全自动毛细管电泳分析仪及配套的试剂等进行血红蛋白电泳检验，电压为9.8kv，缓冲液的酸碱度为9.