药学分子生物学实验1.pptVIP

实验1 质粒DNA的提取 实验2 聚合酶链反应（PCR）扩增质粒DNA 实验3 限制性核酸内切酶酶切质粒DNA 实验4 琼脂糖凝胶电泳鉴定;实验基本操作;微量高速离心机操作;移液器规范操作;移液器规范操作;第一步：设定移液体积;第三步:吸取液体;垂直吸液 吸头尖端需浸入页面3mm以下 缓慢吸液 ;第四步:放液 ;用大量程的移液器移取小体积的液体 装配吸头时气密性不好，吸头不匹配 吸液速度和放液速度太快 ;废弃物的处理;实验报告;实验1 质粒DNA的提取 －碱裂解法 ;质粒（plasmid）;菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，DNA（质粒DNA和染色体DNA）发生变性（强碱破坏碱基配对） 加入酸性液中和后，闭环质粒DNA链能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；染色体DNA不能复性，沉淀下来。;收集细菌，吸取1ml菌液，10000rpm/5min，弃上清。 加入100ul 溶液I（EDTA, 葡萄糖、Tris-HCl），在震荡器上重新悬浮沉淀。 加入200ul 溶液II（NaOH, SDS），盖上盖子，颠倒混匀5min。打在盖子可见拉丝现象。 加入150ul 溶液III（醋酸、醋酸钠），盖上盖子，颠倒混匀后插冰上冰浴5min。可见白色沉淀（基因组DNA、变性蛋白质SDS的混合物）。 10000rpm/5min，将上清转移至新的EP管中。 以上步骤实现了质粒DNA与基因组DNA的分离;6. 加入500ul酚氯仿混合液，盖上盖子后，摇晃管子混合液体，放置室温5min。 7. 10000rpm/5min，将上清转移至新的EP管中。 注意：不要吸取中间的白色沉淀。 以上步骤实现了去除蛋白质的作用。 ;;;实验2 聚合酶链反应（PCR）扩增质粒DNA ;PCR扩增重组质粒DNA的GAPDH基因片段;重组质粒DNA;PCR反应体系（20 μl ）;PCR反应程序;紫外投射分析仪; 实验3 限制性核酸内切酶酶切质粒DNA ;简称限制酶，是一类能识别和切割双链DNA分子内特定碱基顺序的核酸内切酶，为原核生物所特有。 Ⅱ型限制酶被称为基因工程的分子剪刀。;限制性核酸内切酶 作用模式:;载体: 能将外源DNA片段导入宿主细胞进行扩增或表达的工具。本质为DNA。;重组质粒DNA;限制酶切反应体系（20 μl ）;限制性内切酶反应影响因素： ;? 根据特异识别序列切割DNA片段 ? 用于基因组计划研究（物理??谱，基因定位，DNA同源性分析 , DNA甲基化碱基的识别与切割） ? 限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism, RFLP）研究，用于法医学个体识别和遗传性疾病的诊断;二、限制性片段长度多态性分析 （RFLP restriction frgment length polymorphism ）;苯丙酮尿症（PKU）; 实验4 琼脂糖凝胶电泳鉴定 核酸产物 ;琼脂糖：;琼脂糖凝胶电泳原理：;1;上样缓冲液 (Loading Buffer);荧光染料 (SYBR Green I);DNA 分子标准物 (DNA Marker);琼脂糖凝胶电泳：;影响DNA电泳迁移率的主要因素：;线性双链DNA分子迁移率与其相对分子量成反比：;相同分子量不同构型的DNA分子迁移率不同：;琼脂糖凝胶浓度(%);PCR产物电泳图：;质粒DNA电泳图：;琼脂糖凝胶电泳操作步骤：;琼脂糖凝胶电泳操作步骤; DNA分离、纯化、鉴定的常用方法； 电荷效应；分子筛效应； 分离分子量/构型（构象）不同的DNA分子 ;-;琼脂糖凝胶电泳;荧光染色原理;SYBR Green I 工作原理;紫外投射分析仪; 实验3.3 琼脂糖凝胶电泳鉴定 质粒DNA及酶切产物 ;琼脂糖凝胶电泳操作步骤;重组质粒DNA;限制酶切产物分析;限制性内切酶反应影响因素： ;思考题;思考题：