酶工程第五章 酶分子修饰.pptVIP

Chapter 5 Modification of Enzyme Molecule; 通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的催化特性的技术过程。 属于酶分子工程的一部分。; 酶分子修饰的意义;第一节 金属离子置换修饰;一、金属离子置换修饰的方法;二、金属离子置换修饰的作用;通过修饰提高酶活力;增加酶稳定性;降低或消除抗原性;第三节 酶蛋白侧链基团修饰; 其侧链功能基团有氨基、羧基、巯基、咪唑基、吲哚基、酚羟基、羟基、胍基、甲硫基等，这些基团可组成各种副键对蛋白质空间结构的形成和稳定起重要作用。这些功能基团发生改变，引起副键改变，使空间结构发生某些变化，从而引起酶特性和功能的改变。;（1）氨基修饰 （2）羧基修饰 （３）巯基修饰 （４）胍基修饰 （5）酚基修饰 （６）咪唑基修饰 （７）吲哚基修饰 （８）分子内交联修饰;三硝基苯磺酸（TNBS）是非常有效的氨基修饰剂。; 多肽链N-末端残基的化学修饰： 2,4-二硝基氟苯（DNFB）法、 丹磺酰氯（DNS）法、 苯异硫氰酸酯（PITC）法。;碳二亚胺修饰酶的羧基已成为最普遍的方法，条件温和。;巯基的化学修饰;1、烷基化试剂（如碘乙酸等）； 2、N-乙基马来酰亚胺。 ;;酚基的化学修饰;分子内交联剂;有同型双功能试剂、异型双功能试剂。;第四节 肽链有限水解修饰;利用酶分子主链的切断和连接，使酶分子的化学结构及其空间结构发生某些改变，从而改变酶的特性和功能的方法。 酶蛋白主链修饰主要是靠酶切/酶原激活法。;b、胰蛋白酶原（trypsinogen）的激活 ;第六节 氨基酸置换修饰;催化剂：酪氨酰-tRNA合成酶。 其第51位苏氨酸换成脯氨酸，对ATP的亲和性提高近100倍，酶活力提高25倍。;β-干扰素的稳定性 （修饰后低温保存半年，活性不变）。;二、氨基酸置换修饰的方法;２、定点突变法;;第八节 物理修饰;第九节 酶分子修饰的应用;一、在酶学研究方面的应用;二、在医药方面的应用;四、在抗体酶研究开发方面的应用;一、抗体酶概述;抗体结构 抗体分子是由两条轻链( L链)和两条重链(H链)通过链间二硫键连接而成的四肽链结构。 ;1969年， Jentcks根据Panling的化学反应过渡态理论预言，用过渡态类似物，作为半抗原，产生的抗体，该抗体具有酶催化反应的基本特征。 1986年《Science》同时发表了两篇来自由Lemer和Schultz分别领导的两个研究组的发现具有酶催化能力的抗体研究报告，揭开研究抗体酶的热潮。 取得的成果： 天然酶所催化的6种酶促反应 数十种类型的常规反应的抗体酶。包括酯、羧酸和酰胺键的水解，酰胺形成，光诱导裂解和聚合，酯交换，等等。 ;抗体酶（abzyme）：是抗体的高度选择性和酶的高效催化能力巧妙结合的产物，本质上是一类具有催化活力的免疫球蛋白，在其可变区赋予了酶的属性，也叫催化抗体。 特点： 1、反应专一性相当于或超过自然酶反应的专一性， 2、催化速度有的可达到自然酶催化的水平。但一般来说比非催化反应快 102～106倍，比天然酶催化反应速度慢，仅为它的 10-4-10-2。 革命尚未成功，同志仍需努力。 ;二、抗体酶的制备方法 1. 诱导法 以Pauling的稳定过渡态理论为指导，即酶的催化在于能结合底物产生过渡态，降低能障（反应的活化能）。 以过渡态类似物作为半抗原，诱导与其互补构象的抗体，使其具有催化活性，可观察到抗体催化相应底物发生化学反应。 ; 用设计好的半抗原，通过间隔链与载体蛋白??如牛血清白蛋白）偶联制成抗原。然后对动物进行免疫，取免疫动物的脾细胞与骨髓瘤细胞杂交，杂交细胞分泌单克隆抗体，经筛选和纯化，得到抗体酶。;例 ： Schultz研究小组以羧酸二酯水解反应的 过渡态类似物对硝基苯磷酰胆碱作为半抗原，诱 导产生单克隆抗体，经过筛选找到一株 MOPC167。使水解反应速度加快 12 000倍。 ;2. 抗体结合部位修饰法 ; 在抗体的抗原结合部位引入催化基团。 方法有两种： （1）选择性化学修饰法 （2）基因工程定点突变法 ;例：使用可裂解亲和标记物将含巯基的柄状亲核基团引入到抗2，4-二硝基苯酚（DNP）的单抗的抗原结合位点，得到的抗体酶对含有(DNP)与香豆素的羧酸酯的水解反应的催化效率比二硫苏糖醇高104倍。;（2）基因工程定点突变法 通过基因工程，精确地将催化基团引入到抗体的结合部位上。 例：Schultz小组用此法将催化基团组氨酸插入到对二硝基苯专一的抗体（MOPC315）的结合部位。合成了VL片断的