重组DNA1技术1.pptVIP

BamH1 GGATCC CCTAGG HaeIII GGCC CCGG Cohesive Ends (5′ Overhang) Cohesive Ends (3′ Overhang) KpnI GGTACC CCATGG Blunt Ends (No Overhang) Restriction Enzymes GATC CTAG DpnI (Requires methylation) Methylation-sensitive Enzymes GGCC CCGG HaeIII (Inhibited by methylation) CCCGGG GGGCCC XmaI (5’ Overhang) CCCGGG GGGCCC SmaI (Blunt Ends) Isoschizomers Enzymes Generating Compatible Cohesive Ends GGATCC CCTAGG BamHI (5’ Overhang) AGATCT TCTAGA BglII (5’ Overhang) CTCGTG GAGCAC BssSI (5’ Overhang) NNCAGTGNN NNGTCACNN TspRI (3’ Overhang) Enzymes Recognizing Non palindromic Sequences Restriction Enzymes 部分常用限制性内切酶 特异识别: 4或6个碱基 回文结构 特异切割 5’突出黏末端 5’-overhang cohesive end 3’突出黏末端 3’-overhang cohesive end 平末端 blunt end 同序同切酶 同序异切酶 同 裂 酶 同 尾 酶 Compatible end 可配伍的末端 制备可控特异片段 5’-CCGCGGTGGCGGCCGCTCTAGAACTAGTGGATCCCCCGGGCTGCAGGAATTCGATATCAAGCTTATCGATACCGTCGACCTCGAGGGGGG -3’ 只写出了一条链的序列信息。 找一找 5’-CCGCGGTGGCGGCCGCTCTAGAACTAGTGGATCCCCCGGGCTGCAGGAATTCGATATCAAGCTTATCGATACCGTCGACCTCGAGGGGGG -3’ 只写出了一条链的序列信息。 选取的是载体上的多克隆位点。 正确答案？ Restriction enzyme analyse by NEB Cutter 举例说明限制性内切酶反应的设置 DNA 1 ?g 10x NEB buffer 3 10 ? L 100x BSA 1 ?L BamHI 1 unit H2O 补充体积至100 ? L 最适反应温度下保温适当时间。 100ul 反应 限制性内切酶反应的影响因素 DNA 的纯度和结构 反应缓冲液的pH及离子浓度 酶解温度和时间 限制酶 限制性内切酶在DNA重组技术中的应用 改造和组建质粒 组建基因组DNA物理图谱 基因组DNA同源性研究 DNA重组克隆及亚克隆 DNA杂交与序列分析 分析限制性片段长度多态性 Restriction fragment length polymorphism, RFLP Restriction Enzyme Mapping BamH1 XhoI XhoI 1.1 kb 1.7 kb 1.2 kb 2.8 kb 4.3 kb 3.7 kb 2.3 kb 1.9 kb 1.4 kb 1.3 kb 0.7 kb BamH1 XhoI BamH1 XhoI 4.0 kb 2.8 kb 1.2 kb 1.7 kb 1.2 kb 1.1 kb 还有其它可能性 ? DNA ligase DNA连接酶是一种封闭DNA链上切口的酶，它借助ATP 或NAD（辅酶I，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 ）水解提供的能量催化一段DNA链上临近的5’磷酸末端和3’羟基末端生成磷酸二酯键，把两个DNA片段连接在一起，从而封闭双链DNA上的切口。 3`5`磷酸二酯键 nick T4 DNA ligase: rATP, 互补的粘性末端，平末端 E.Coli DNA ligase: NAD, 互补的粘性末端，平末端 两类常用DNA连接酶及其辅助因子 焦磷酸部分 AMP部分 AMP部分 NMN部分 rATP NAD+ 连接机制：3步骤 NAD NMN