桑国俊 牛卵母细胞体外培养技术研究PPT.ppt

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桑国俊 牛卵母细胞体外培养技术研究PPT

* * 桑国俊 甘肃省畜牧兽医研究所 一 发展背景 二 试验内容 三 结果与分析 四 总结 一 发展背景 随着胚胎工程技术的深入研究和商业性胚胎移植技术的发展,胚胎需求量日益增加,单纯依靠超数排卵获得体内胚的方法成本高、采胚数量有限,不能满足科研和生产的需要。卵母细胞体外胚生产体系的建立将成为胚胎生产的主要突破点。深入研究卵母细胞体外胚及其冷冻保存的技术机理,建立一套完全在体外培养条件下快速生产和保存胚胎的技术体系,挖掘优良母畜的繁殖潜力,具有巨大的科研价值与现实意义 牛胚胎体外生产技术的累积效率低、技术复杂、实验条件高,受培养基、卵泡液、共培养细胞等因素影响大,还缺乏统一的理论依据和程序化的标准方案,仍处于探索阶段。因此,还必须不断改进和完善胚胎体外培养和生产体系 试验内容…试验设计 1 卵母细胞体外成熟培养 1.1 COCs级别对卵母细胞成熟的影响 1.2 卵泡直径对卵母细胞成熟的影响 2 卵母细胞体外受精 2.1 不同离心方法对精子获能和卵母细胞受精的影响 2.2 不同上浮方法对精子获能和卵母细胞受精的影响 2.3 精子浓度对卵母细胞受精的影响 3 胚胎体外培养 3.1 共培养体系对胚胎发育的影响 3.2 培养液体积对胚胎发育的影响 4 冷冻保存COCs的培养 4.1 GL和EG一步法冷冻对COCs的影响 4.2 麦管和OPS管玻璃化冷冻对COCs的影响 SPSS统计分析 三 结果与分析 1 卵母细胞体外成熟培养 1.1 COCs级别对卵母细胞成熟的影响 选择A、B级COCs进行成熟培养 COCs级别 测定数 成熟数 成熟率% A级COCs 409 255 63.80 a B级COCs 427 197 47.80 b C级COCs 339 8 2.01 c D级COCs 186 0 0.00 d C 级COCs 1.2 卵泡直径对卵母细胞成熟的影响 卵母细胞的成熟率与卵泡直径关系密切,在卵母细胞体外培养过程中,宜选择卵巢发育正常的卵泡采集,而不宜选择发育过大或过小的边际卵泡 卵泡直径 样本 成熟 成熟率 φ<2mm 649 128 19.06 b φ2~8mm 945 578 61.84 a φ>8mm 147 30 17.07 c 2 卵母细胞体外受精 2.1不同离心法对精子获能和卵母细胞受精的影响 ①二次离心沉淀液:精子活力0.44;获能效果10min最高为0.41,15min为0.32,超活化以15min时最好;受精率为40.19% ②二次离心上清液:精子活力0.56;获能效果10min最高0.59,15min时较低为0.585,超活化也以15min时最好;受精率为43.21% 洗涤精 子活力 样本 均数 冻精解 冻活力 20 0.41 c 2次离心 上清液活力 20 0.56 a 2次离心 沉淀液活力 20 0.44 b 从试验结果看,宜选用上清液15min组的获能精子进行体外受精。本试验突破了精子离心法的传统方法,避开了单纯利用沉淀液进行精子获能的思路,而直接对上清液进行离心处理,获得了理想的精子洗涤和获能效果 精子获能 活 力 超活化效果 2.2 不同温度上浮法对精子获能和卵母细胞受精的影响 室温上浮法: 20~24℃室温。上浮60min,45min活力最高0.68,对其获能15min后进行体外受精,平均受精率41.40% 室温上浮 精子活力 冻精 0.5000 g 上浮15min 0.5667 c 上浮20min 0.6200 b 上浮25min 0.5933 bc 上浮30min 0.6100 bc 上浮35min 0.5467 df 上浮40min 0.5900 bce 上浮45min 0.6800 a 上浮50min 0.6233 b 上浮55min 0.6033 bc 上浮60min 0.5267 de 恒温上浮法:CO2培养箱(38.5℃)上浮60min,30min活力最高0.697,对其获能15min体外受精,受精率41.51% 恒温上浮 精子活力 冻精活力 0.4800 d 上浮15min 0.5367 c 上浮20min 0.5933 b 上浮25min 0.6067 b 上浮30min 0.6967 a 上浮35min 0.5867 b 上浮40min 0.5300 c 上浮45min 0.4633 d 上浮50min 0.4367 d 上浮55min 0.4100 e 上浮60min 0.3867 e 二种不同上浮方法的精子活力和受精率之间差异不显著(p>0.05),恒温上浮法的效果略高于室温组。室温随着季节和气候变化

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