基因组学与系统毒理学.ppt

（一）双向凝胶电泳（2-dimensional gel electrophoresis, 2-DE） 样品制备 原理：细胞抽提物在电泳过程中，依据蛋白质所带电荷及分子大小而被分离。 实验成败的关键 要尽可能使样品转变为适合进行电聚焦的状态，同时保持原有的电荷和等电点 为尽可能多地获得样品中的蛋白质，可采用预分级处理方法 根据蛋白质溶解性的不同进行分步顺序提取，增强特定蛋白点的浓度，提高低丰度蛋白质的上样量； 预先对细胞亚结构进行分离，利用传统梯度离心法分离各种细胞器，再提取蛋白进行二维电泳，建立相应的亚细胞蛋白质组数据库 毒理基因组学与系统毒理学 * * 电泳 ?梯度凝胶电泳： 使用窄pH及极窄pH范围梯度凝胶电泳，提高2-DE分辨率。 适用于低丰度蛋白的检测 ?胶上差示电泳（differential in-gel electrophoresis, DIGE） 将不同样品蛋白质标上不同的荧光染料，在同一块胶上进行电泳分离，用荧光扫描仪进行识别。 该方法重复性好，灵敏度高，质谱兼容等优点。 缺点 不能很好显示低丰度蛋白、疏水性膜蛋白、极酸或极碱性、极大和极小分子量蛋白； 不同样本间难以进行定量比较； 费时、费力，不容易自动化； 重复性差。 毒理基因组学与系统毒理学 * * （二）生物质谱技术（biological mass spectrometry BMS） 基本原理：使样品分子离子化后，根据不同离子间质荷比（m/z）的差异来分离并确定相对分子质量。 ?基质辅助激光解吸离子质谱（metrix assisted laser desorption ionization mass spectrometry，MALDI） ?电喷雾离子化质谱（electrospray ionization mass spectrometry，ESI） ?表面增强激光解吸电离-飞行时间质谱（surface-enhanced laser desorption ionization ，SELDI） 结合芯片和质谱技术，将蛋白质样品制备、生化反应和检测分析等过程集成在芯片上进行，在数分钟内同时分析几百种蛋白质，样品体积可低至0.5μl，利于微量样本研究。 毒理基因组学与系统毒理学 * * ?多向蛋白鉴定技术（multi-dimensional protein identification technology，MudPIT) 将蛋白质酶解后得到多肽混合物，进样到强阳离子交换色谱柱，直接洗脱后进样到反相液相色谱柱上，然后进行梯度洗脱，用MS/MS对分离的馏分进行鉴定。 一个分析周期可检测100多种蛋白质，适用于大规模蛋白质的分离鉴定。 ?同位素亲和标签（isotope-coded affinity tag，ICAT） 利用化学性质相同而质量不同的两种同位素分子，对蛋白样品的半胱氨酸进行标记，然后对混合的样品进行质谱分析，通过比较质谱峰的强弱可以对蛋白质进行定量比较。 具有广泛的兼容性和高度专一性，而且适用于低丰度蛋白分析，是差异蛋白质组定量分析研究的有力工具。 毒理基因组学与系统毒理学 * * ?分子扫描技术（molecular scanner technology） 将双向凝胶转到涂有酶解液的膜上，在转膜的同时进行酶切，再利用质谱扫描鉴定 ?抗体与蛋白质阵列技术（antibody and protein array technologies） 将双向凝胶转到涂有酶解液的膜上，在转膜的同时进行酶切，再利用质谱扫描鉴定 毒理基因组学与系统毒理学 * * 三、代谢组学技术平台 代谢组学（metabonomics/metabolomics）是研究关于生物体被扰动后其代谢产物（内源性代谢物质）种类、数量及其变化规律的科学。 代谢组学研究生物整体、器官或组织的内源性代谢物质的代谢途径及其所受内在和外在因素的影响及随时间变化的规律。 ?作为全局系统生物学的基础和重要组成部分，代谢组学是以物理学基本原理为基础的分析化学、以数学计算与建模为基础的化学计量学和以生物化学为基础的生命科学等学科交叉的学科。 ?作为基因组、转录组和蛋白组的“终端”，能够更直接、更准确地反映生物体的病理生理状态。 毒理基因组学与系统毒理学 * * 技术路线及方法 检测和分析内源性代谢物信息技术 ?核磁共振（NMR） ?色谱及联用技术（GC-MS\LC-MS） ?红外光谱(IR spectrum） ?毛细管电泳（CE） 采样（血样尿样或其他） 代谢物的提取 上机检测（GC-MS\LC-MS\NMR） 数据预处理（信息峰提取、识别） 多元变量统计分析（PCA、PLS-DA、OPLS-DA） 深度数据挖掘（代谢通路分析、关联分析） 毒理基因组学与系统毒理学 * * （一）磁共振（nuclear ma