【科技论文】CD146免疫磁珠分选高纯度小鼠肝窦内皮细胞.pdf

试验综述 CD146 免疫磁珠分选高纯度小鼠肝窦内皮细胞 张 磊，任大明* （沈阳农业大学，辽宁 沈阳 110161） 中图分类号 S852.21 文献标识码 A 文章编号 1672-9692(2010)08-0064-04 [ 摘 要] 本研究旨在建立高纯度小鼠肝窦内皮细胞的分离及鉴定方法，为其生物学特性及功能的研究 奠定基础。采用胶原酶灌注、Per col l 密度梯度离心及选择性贴壁培养法去除Kupf f er 细胞，加入CD146 免疫磁珠抗体，进一步分离纯化小鼠肝窦内皮细胞，用vWF 因子免疫细胞化学荧光染色法观察肝窦内皮细 胞表面分子的表达及流式细胞术鉴定肝窦内皮细胞的纯度。试验结果：分离培养的小鼠肝窦内皮细胞得率 6 为（0. 9±0. 1）×10 / 鼠肝，流式细胞术测定细胞纯度达95%以上，细胞活力大于90%，光镜下细胞形态 典型 vWF 因子免疫细胞化学荧光染色大部分为阳性。本试验获得纯度较高小鼠肝窦内皮细胞，确定了小 鼠肝窦内皮流式细胞术检测所需抗体种类。 [ 关键词] 小鼠肝窦内皮细胞；CD146；流式细胞术 肝窦内皮细胞（Liver sinusoidal endothelial cells ， （Becman 公司）；超高速离心机OptimaTML-80XP LSECs）是肝脏中主要的非实质细胞，位于肝窦腔 （Beckman 公司）；CO2 细胞培养箱（Thermo 公 与 Disse 间隙之间，是肝内物质交换的屏障。 司）；免疫磁珠分选（MACS）磁力架、MACS 磁性 LSECs 因富含窗孔结构、缺乏隔膜、内皮下缺少 分离柱（德国Mitenyi 公司）；流式细胞仪（FACS 基底膜而与普通血管内皮细胞不同。LSECs 在肝 Calibur 型，BD 公司）；倒置相差显微镜、倒置荧 脏的生理、病理及肝脏缺血再灌注过程中具有非 光显微镜及照相系统（德国莱卡公司）。 [1] 常重要的作用 。但由于肝窦内皮细胞传统分离方 2 方法 法纯度不高，原代分离培养的肝窦内皮细胞不能 2.1 胶原酶灌注、Pecoll密度梯度离心、选择性 在体外长期存活，限制了对其生物学功能的深入 贴壁培养去除Kupffer细胞 小鼠断劲处死后， 研究，本文旨在建立高纯度小鼠肝窦内皮细胞的 放置于手术台，门静脉插管，用输液泵匀速灌注 分离及鉴定方法，为其生物学特性及功能的研究 37 ℃ GBSS 以10 ml/min 100 ml 左右，阻断肝上 奠定基础。 下腔静脉，以2 ml/min 注入灌注液（0.5% IV 型胶 1 试验材料 原，5%小牛血清）灌注10 min，用10 ml、37 ℃ 1.1 试验动物 雄性9～11 周龄C57BL/6J 小鼠， 新的灌注液（0.5%Ⅳ型胶原，0.001% DNA 酶I，5% 购自北京协和医院动物中心，自由饮食，二级饲 小牛血清）摇床浸泡10 min，去除包膜、血管及 养。分离肝脏前禁食16 h，自由饮水。 结缔组织，悬液用100 目不锈钢筛网过滤，收集 1.2 主要试剂 四型胶原酶购于Sigma 公司， 滤过液。滤过的细胞悬液，先经2 次差速离心收 第Ⅷ因子Von Willebrand Factor （vWF）抗体购于 集非实质细胞，再经 Percoll 密度梯度离心 英国Abcam 公司；RPMI-1640 培养基（内加双抗 （900×g ，20min），收集50%和25%Percoll 界面层 谷氨酰胺），小牛血清（GIBCO），GBSS 自制 富含肝窦内皮细胞的混浊带，离心洗涤（900×g ， ECGF （内皮细胞生长因子）购于德国Boehringer 10 min），沉淀悬于10 ml RPMI-1640 培养基中 公司；Percoll 密度梯度液（美国