柠条锦鸡儿香豆酸-羟化酶基因克隆及其功能初步研究.pdfVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１３，３３（４）：６１６７ 柠条锦鸡儿香豆酸３羟化酶基因克隆 及其功能初步研究 １，２ １ １，３ １ １ 李　高 　杨　杞 　张　烨 　王瑞刚 　李国婧 （１内蒙古农业大学生命科学学院　呼和浩特　０１００１８　２北京市颐和园管理处　北京　１０００９１） （３鄂尔多斯市食品药品检验研究中心　鄂尔多斯　０１７０００） 摘要　香豆酸３羟化酶 （Ｃｏｕｍａｒａｔｅ３Ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ，Ｃ３Ｈ）是木质素生物合成途径中的关键酶之 一。以柠条锦鸡儿为材料，利用ＲＡＣＥ技术克隆了Ｃ３Ｈ基因。对柠条锦鸡儿Ｃ３Ｈ基因的ｇＤＮＡ 和ｃＤＮＡ全长分析显示该基因具有３个外显子，２个内含子，编码框长度为１５３０ｂｐ，编码５０９个氨 基酸。预测该基因编码蛋白的等电点位７．６７，分子量约５７．６１ｋＤａ。氨基酸序列分析显示具有一 个保守的Ｐ４５０结构域。系统进化分析表明该蛋白与大豆Ｃ３Ｈ具有最高的同源性，将该基因命名 为ＣｋＣ３Ｈ，ＧｅｎｅＢａｎｋ登录号为ＨＱ８２９８５８。构建了３５Ｓ启动子驱动的ＣｋＣ３Ｈ基因植物表达载体， 互补拟南芥Ｃ３Ｈ（ＣＹＰ９８Ａ３）基因突变体ｒｅｆ８，转基因植物表型得以部分恢复。这些结果说明柠 条锦鸡儿ＣｋＣ３Ｈ与拟南芥Ｃ３Ｈ至少具有部分相同的功能。 关键词　Ｃ３Ｈ　木质素　序列分析　ｒｅｆ８ 中图分类号　Ｑ７８６ 　　木质素是植物中含量仅次于纤维素的芳香族多聚 少、序列最保守的基因，对木质素的合成起着重要作 物，主要沉积于植物的次生细胞壁和维管组织中，在植 用［６］。对拟南芥 Ｃ３Ｈ（ＣＹＰ９８Ａ３）基因的研究表明，当 物水分运输、机械支撑、抵抗紫外辐射和抵抗病原菌中 Ｃ３Ｈ基因突变后，ｒｅｆ８突变纯合体（ｒｅｆ８／ｒｅｆ８）中木质素 ［１］ 起着重要的作用 。过多的木质素影响饲草的饲用 的总量下降而且组成比例发生改变，植物表现极度矮 性，使牲畜消化率降低；同时木质素含量过高导致工业 小的表型，但ｒｅｆ８突变杂合体植物 （ＲＥＦ８／ｒｅｆ８）与野 利用时成本增加，并造成环境污染，因此通过降低木质 ［７，８］ 生型并没有明显区别 。白杨中降低 Ｃ３Ｈ基因的表 素含量或改变木质素结构逐渐成为基因工程的研究热 达后，木质素总量下降到原来的一半，其中Ｇ型和Ｓ型 点之一［２３］。植物中主要有 １０种酶参与到木质素生物 木质素下降，但是原本含量很低的Ｈ型木质素明显增 合成 途 径 中，香 豆 酸３羟 化 酶 （ｃｏｕｍａｒａｔｅ３ ［９］ ［１０］ 加 。苜蓿中对Ｃ３Ｈ基因的研究也有类似的结果 。 ［４］ ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ，Ｃ３Ｈ）是该途径关键酶之一 。Ｃ３Ｈ属于 因此，Ｃ３Ｈ基因是利用基因工程手段调控植物木质素 细胞色素Ｐ４５０单氧化酶，催化对香豆酰莽草酸／奎宁 含量的一个重要候选基因。 酸 （ｐｃｏｕｍａｒｏｙｌｓｈｉｋｉｍａｔｅ／ｑｕｉｎａｔｅ）到咖啡酰莽草酸／ 　　柠条锦鸡儿 （ＣａｒａｇａｎａｋｏｒｓｈｉｎｓｋｉｉＫｏｍ．）是我国 奎宁酸 （ｃａｆｆｅｏｙｌｓｈｉｋｉｍａｔｅ／ｑｕｉｎａｔｅ）的Ｃ３位置的羟基 西北地区重要的豆科锦鸡儿属饲用灌木，由于