药物敏感性试验.doc

药物敏感性试验　　（一）纸片扩散法　　本实验所用的方法为Bauer-Kirby法，即常用的纸片法。其原理是将干燥的浸有一定浓度抗菌药物的滤纸片放在已接种一定量某种细菌的琼脂平板上。经培养后，可在纸片周围出现无细菌生长区，称抑菌环。测量抑菌环的大小，即可判定该细菌对某种药物的敏感程度。目的是使学生学会此实验方法并了解其在临床治疗上的意义。　　【材料】 　　① 普通琼脂平板培养基 　② 分离培养物　③ 大肠杆菌分离培养物 　　④ 药物纸片 　　⑤ 酒精 　　⑥ 镊子 　　【方法】 　　1．按无菌操作法用接种环从分离培养平板上已选好的菌落沾取细菌，反复交叉密涂于平板培养基上，以便生长出均匀的菌苔(注意不要划破培养基)。 　　2．用沾酒精点燃灭菌的小镊子取药物纸片按图3-5贴于平板培养基上，并轻轻按压贴紧。 　　3．做好标记，放37℃温箱培养过夜(不超过17h)。　　【结果观察】　　观察纸片周围有无抑菌环，并测其直径大小。最终判断细菌对每种抗菌药物的敏感程度，记录和报告结果。　　判定标准：实验条件不同判定标准可有所不同。一般抑菌环直径在15mm以上者为高度敏感，10～15mm为中度敏感，10mm以下为低度敏感，无抑菌环者为耐药。 　　　　　　　　　　　　　　　　　【附录】 　　药物纸片的制备：取普通滤纸用打洞机打成直径6mm的圆形纸片，浸于一定浓度的抗生素中，每枚纸片的药物含量：青霉素1u，其它抗生素10μg，磺胺100μg。　　（二）试管稀释法　　【原理】　　以水解酪蛋白(M-H)液体培养基将抗生素作不同浓度的稀释，然后接种入待检细菌，定量测定抗菌药物抑制或杀死该菌的最低抑菌浓度(MIC)或最低杀菌浓度(MBC)。　　【材料】　　1．菌种：金黄色葡萄球菌菌液(105CFU／ml)。 　　2．培养基：MH肉汤，去脂肪筋膜牛肉300g绞碎，加蒸馏水1000ml，制成肉浸液。将可溶性淀粉1.5g水解酪蛋白17.5g加入肉浸液内，加热熔化后调pH至7.4，15磅/英寸2高压灭菌l5min备用。 　　3．100u／ml的青霉素钾盐 　　【方法】　　1．取无菌小试管10支排于试管架，于第一管加入MH肉汤1.9ml，2-10管各加1ml。 　　2．于第一管加入稀释好的100u／ml的青霉素钾盐0.1ml，混匀后取1ml加入第2管，依次倍比稀释，自第9管吸出1ml弃去，第10管为对照管(表3-1)。 　　3．将各管中加入已校正浓度的金黄色葡萄球菌菌液(105cfu／ml)0.05ml，混匀后放置35℃培养18h，观察结果。　　　　　　　　　　　　　　　　　　表3-1青霉素液稀释法　　　　　 　　【结果】 　　确定无细菌生长的药物最高稀释管，该管的浓度即为该菌对此药物的敏感度，即MIC。　　（三）琼脂稀释法　　【原理】 　　琼脂稀释法敏感试验是将不同剂量的抗菌药物，分别加入融化并冷至45℃的定量琼脂培养基中，混匀，制成无菌平板，即为所含药物浓度递减的培养基。接种幼龄菌于该培养基上，经培养后观察被检菌的生长情况，抑制细菌生长的最低药物浓度为该抗生素对该菌的最低抑菌浓度。 　　【材料】　　1．菌种：金黄色葡萄球菌菌液(108CFU／ml) 　　2．培养基：水解酪蛋白（MHA）培养基(MH肉汤1000ml，调pH值后，加17g琼脂，分装后15磅/英寸2高压灭菌l5min备用)　　3．抗菌药物原液（1280μg/ml） 　　4．麦氏比浊管，校正待检菌浓度用。 　　【方法】　　1．制备含药琼脂平板：将药液倍比稀释，至15个不同浓度，用15个无菌90mm平皿分别加各个浓度的抗生素2ml于其中，再加入45℃MH琼脂18ml，充分混匀，冷却凝固(接种前平板必须相当干燥)。 　　2．取已校正浓度的待检菌液(108CFU／ml)接种于含药琼脂的表面，操作时从最低浓度的琼脂种起，使每滴约2μl菌液，每一接种点的液滴直径为5～8mm，注意勿使移动，待接种点干燥后，再将平板翻转，置35℃孵箱内孵育16～24h观察结果。　　【结果观察】　　不出现菌落的琼脂平板上的最低药物浓度为其最低抑菌浓度。结果可用药物的浓度报告。若超过抑菌终点仍有数个明显菌落，应考虑试验菌的纯度而予以复试，如仅为单个菌落，可予以忽略。判定时应注意：①薄雾状生长不算；②＜5个菌落不算；③若在数个平板上呈拖尾或跳管生长等现象，应该重做。