食管癌p53基因甲基化及其表达分析.docVIP

精品论文 参考文献 食管癌p53基因甲基化及其表达分析 王学才1 汤俊明1 朱燕2 （1宜兴市人民医院 江苏宜兴 214200；2宜兴市第四人民医院中医科 江苏宜兴 214200） 【中图分类号】R735.1 【文献标识码】A 【文章编号】1672-5085 (2010)30-0170-02 【摘要】 本文通过检测食管癌组织中p53基因甲基化状态和p53 蛋白表达情况，得出结论：p53 基因高甲基化状态引起的突变或失活是食管癌发生发展的重要因素之一。 【关键词】 p53基因 甲基化 食管癌 免疫组化 在真核生物中,5甲基胞嘧啶主要出现在CpG序列,是p53基因突变频发部位,约40%的点突变发生在该序列,为此,我们应用限制性内切酶酶切PCR及免疫组化方法，检测食管癌组织p53基因第5外显子CpG二核苷酸甲基化状态,以及该基因蛋白水平的表达，并探讨p53基因甲基化状态在食管癌发生中的作用。 1 材料和方法 1.1材料 检测标本来自宜兴市人民医院2007年11 月～2009年12月的食管癌患者手术切除标本共100例,每例标本含食管癌组织和癌旁组织各一份,其中高、中分化腺癌43例,低分化腺癌57 例, 69例有淋巴结转移。另5例正常人食管黏膜标本来自我院病理科,用作正常对照。以上病例均经病理诊断,标本在离体后一部分固定后石蜡包埋,另一部分常规酚-氯仿提取DNA,-20℃保存。 1.2免疫组化 免疫组化采用ABC 法,单克隆抗体生物素化的兔抗鼠Ig G 和ABC 复合物均来自晶美公司。选取正常组织为对照。光镜下观察75%以上肿瘤组织未见核染色判断为阴性,否则为阳性。 1.3 DNA限制性内切酶酶切 1ug DNA加HpaII10 U (或MspI 10U )和10times;Buffer 2 ul 补水至20ul,充分混匀置37℃过夜rarr;加入50ul 冰乙醇沉淀rarr;离心(1200g,5分钟)rarr;蒸馏水溶解酶切后DNA。 1.4 p53基因第5 外显子PCR 扩增 在p53基因第5外显子两边相邻内含子内设计引物[1],上游序列为: 5prime;-TTCAACT CTGTCTCCTTCCT-3prime;；下游序列为:5prime;-CA GCCCTGTCGTCTCTCCAG-3prime;。扩增片段长度248bp,反应体系50ul,总体积包含有0.2mMdNTP,1uM上、下游引物,3UTaqDNA多聚酶,1times;PCR缓冲液。酶切后DNA1ug充分混匀后, 覆盖石蜡油,进行循环扩增。循环参数为94℃变性60秒,55℃复性2分30秒,72℃延伸2分30秒, 40次循环,72℃10分钟。取30ul PCR 产物在2%琼脂糖凝胶中电泳,紫外透射检测电泳带并照相。 1.5 DNA甲基化分析原理 HpaII是甲基化敏感限制性内切酶,如DNA 中CCGG 序列第二位胞嘧啶发生甲基化则不被HpaII所识别,而MspI 是甲基化不敏感限制性内切酶, DNA中CCGG 序列第二位胞嘧啶发生甲基化与否均可识别。 1.6 统计分析 实验结果采用x2检验分析。 2 结果 2.1 p53蛋白表达水平 在所有组织的免疫组化检测中,正常对照和癌旁组织均无p53蛋白表达。癌组织中有71例p53蛋白表达阳性，与分化程度、淋巴结转移均不相关。 2.2 p53基因第5外显子甲基化状态的判定 p53基因第5外显子序列中只包含一个5prime;-CCGG -3prime;位点, 发生甲基化时, HpaI不能识别,PCR 产物电泳显示一条248 bp 特异性带。若HpaII、MspI酶切后, PCR 不能扩增出248 bp 特异性带,表示5prime;-CCGG-3prime;序列中第二位胞嘧啶未发生甲基化, 但酶切后由于单向PCR扩增,可见到较弱的175bp电泳带。P53基因甲基化与其蛋白表达密切相关, 甲基化与分化程度、淋巴结转移不相关。 3 讨论 p53蛋白是53kD的核磷酸蛋白质,参与细胞周期和细胞增殖的调节。因为正常细胞中p53蛋白含量较低,半衰期短,所以正常组织测不到p53蛋白表达。当p53基因发生突变时,所表达的p53蛋白构型发生变化,稳定性增加,在细胞内半衰期延长，这种构型发生变化的蛋白具有促进正常细胞恶性转化，导致细胞恶性增殖的功能,此时恶变的组织中可检测出p53蛋白[2]。 本研究显示,p53蛋白在食管癌组织中有较高的表达率, 近年来研究表明, p53基因第5外显子甲基化是抑