第五章 分子生物学研究方法(上)-1.ppt

张会勇 生命科学技术学院;;生物科学成为当今世界自然科学的热点和重点，主要由于两方面的原因： ;;;基因操作：主要包括DNA分子的切割与连接、核酸分子杂交、凝胶电泳、细胞转化、核酸序列分析以及基因的人工合成、定点突变和PCR扩增等，是分子生物学研究的核心技术。 基因工程：指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子中，构成遗传物质的新组合，使之进入原先没有这类分子的寄主细胞内并进行持续稳定的繁殖和表达。因此，基因工程技术其实是核酸操作技术的一部分 ;1、重组DNA技术 2、DNA基本操作技术 3、RNA基本操作技术 4、SNP的理论与应用 5、基因克隆技术 6、蛋白质组与蛋白质组学技术;5·1 重组DNA技术;④限制性内切酶的发现： ;⑤连接酶的发现：1967年世界上5个实验室几乎同时发现了DNA连接酶，1970年Khorana又发现了T4 DNA连接酶，它具有更高的连接活性，现广泛应用于DNA操作中。 ;;基因工程诞生的标志;基因工程的诞生（一九七三年）;1.目的基因的获得;切 接 转 增 检;重组DNA技术的四大要素 ①外源基因； ②工具酶； ③载体； ④受体细胞。 ; ●核酸内切限制酶，是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。; ● DNA连接酶 ——基因工程的缝纫针;图5-2 DNA连接酶能把不同的DNA片段连接成一个整体 ;●主要载体系统;理想载体的基本条件;;;根据质粒载体的用途进行分类;常见的克隆载体;质粒克隆载体;质粒DNA的构型：;质粒载体的一般结构;表达载体(expressing vector);宿主菌或受体细胞;导入重组体主要方法 ;(插入失活法) 抗药性标记选择; 如：pUC118质粒的多克隆位点整合在lacZ基因中，该位点如果没有插入外源目的基因，lacZ基因便可表达出?半乳糖苷酶，如果平板培养基中含有IPTG（乳糖操纵子的诱导物）和X-gal（ ?半乳糖苷酶的底物）便会被?半乳糖苷酶水解成蓝色，大肠杆菌形成蓝色克隆。 在多克隆位点插入外源目的基因，破坏了lacZ基因的结构，大肠杆菌形成白色的克隆; ;酶切鉴定 用抗生素筛选、蓝白筛选等方法筛选出的菌落需进一步进行酶切分析，鉴定插入片段的大小和插入方向。 （1）? 插入片段大小的鉴定 （2） 插入片段方向性的鉴定 ;重组DNA技术操作的主要步骤; 一般克隆基因的检查和鉴定方法;Contents;5·2 DNA基本操作技术;5.2.1凝胶电泳(gel electrophoresis); DNA在中性或偏碱性的缓冲系统中带负电，把DNA分子放置在电场当中，它们就会向正电极的方向迁移。;琼脂糖凝胶电泳：70bp-50kb DNA 聚丙烯酰胺凝胶：1kb DNA 脉冲场凝胶电泳：上百万bp DNA ;称样;侧视;;样品制备 ;电泳;紫外灯下显色;电泳染色;溴化乙锭（EB）是一种具扁平分子的核酸染料，可插入DNA或RNA分子的碱基之间，并在300纳米波长的紫外光下放射出荧光，指示出凝胶介质中DNA谱带的位置；而在适当染色条件下，电泳谱带的荧光强度是同DNA片段的大小成正比的。;紫外灯下显色;;M marker 1.2 普通Taq酶 3.4 hotstart Taq酶;;3.聚丙烯酰胺凝胶电泳polyacrylamide?gel?electrophoresis （PAGE）;聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE);4.脉冲电场凝胶电泳(pulsed-field gel electrophoresis，简称PFGE) 分离50kb超大分子量的DNA分子 PFGE施加在凝胶上至少有两个电场方向，时间与电流大小也交替改变，使得DNA分子能够不断地调整泳动方向，以适应凝胶中不规则的孔隙变化，达到分离大分子线性DNA的目的。;图5-4 DNA脉冲电场凝胶电泳示意图 ;5·2·2 细菌转化;导入重组体主要方法 ;重组DNA分子导入大肠杆菌;Ca2+与细菌细胞膜磷脂层在低温（0 ℃）下形成液晶结构，后者经热刺激（42℃）发生收缩作用，使细胞膜出现许多间隙，为DNA分子提供了进入细胞的通道。;感受态细胞：为提高效率，可对受体菌进行物理或化学处理，增加其获取DNA的能力。经过这种处理的细胞被称作感受态细胞（competent cells）。;大肠杆菌;噬菌体作载体将DNA注入到寄主细胞中的方法;电穿孔法 电脉冲可以在细胞膜上造成小凹陷，形成疏水孔洞。随着跨膜电压增加，大疏水性孔洞会转变为亲水性孔洞，介质中的DNA进入细胞质。 将生长至对数中期的E. coli菌液冷却至4℃后离心，洗菌后用10%的甘油悬浮，将高密度菌液（~2×1010/