分子生物学 第四章 核酸的体外扩增.pptVIP

四、PCR反应特点 第三节 逆转录PCR 三、RT-PCR的原理 9、重组PCR 7、彩色PCR 8、原位PCR 用不同的荧光物质标记引物5′端，扩增后产物可发出不同颜色的荧光。 将组织固定，处理细胞内的DNA或RNA后，进行PCR扩增。 用合成带突变的引物，复制完整的突变基因。 （研究基因结构与功能的关系） 11、定量PCR 10、差异显示PCR （筛选和克隆差异表达基因） 将所要比较的两种mRNA样品逆转录生成cDNA第一链，再用3′锚定引物和5′随机引物进行PCR反应，通过电泳比较PCR产物的差异片段，再经过片段回收、再扩增和mRNA杂交分析、克隆及序列分析，最终确定差异表达的基因。 （对mRNA进行定量测定） 用PCR反应结束时的DNA含量来推测模板DNA的量，通常用正常稳定表达的基因作参照。 第二节 连接酶链反应 （Ligase chain reaction，LCR） ? 连接酶链反应的最大优势在于能准确地分析基因序列中单个碱基突变。LCR的引物是两对分别互补的引物，引物长度为20～26个。LCR识别点突变的特异性高于PCR，其特异性首先取决于引物与模板的特异性结合，其次是耐热连接酶的特异性。 LCR的基本原理：利用DNA连接酶特异地将双链DNA片段连接，经变性-退火-连接三步骤反复循环。若引物对与模板完全互补，则在DNA连接酶作用下，使得相邻两个引物A和B、A ′和B ′连接、扩增。若引物所对应的模板发生了碱基突变，引物间就不能连接和扩增。 LCR原理示意图 变性 3′ 5′ 5′ 3′ 退火 3′ 5′ 5′ 3′ 3′ 5′ 5′ 3′ A A ′ B B ′ 连接 3′ 5′ 5′ 3′ 变性、退火、连接 3′ 5′ 5′ 3′ （RT—PCR） 所谓逆转录，是指以RNA为模板，利用宿主细胞中4种dNTP为原料在引物的3 ′端以5′ 3′ 方向合成与RNA互补的DNA链的过程，此过程与中心法则相反，故称为逆转录（reverse transcription）。在逆转录过程中以RNA指导的DNA聚合酶称为逆转录酶（reverse transcriptionase）。实际上，逆转录并非转录，而是一种复制形式，必须有引物存在才能完成。 一、逆转录 二、逆转录酶 1970年Temin在Rous肉瘤病毒、Baltimore在白血病病毒中各自发现了逆转录酶，以后发现所有RNA肿瘤病毒中都含有逆转录酶。逆转录酶是逆转录病毒RNA编码的，是多功能酶： ①具有RNA指导的DNA聚合酶活性，能和其它DNA聚合酶一样，沿5′ 3′ 方向合成DNA，并需要引物提供3′—OH ； ②具有RNA酶H（RNaseH）活性，能特异性水解RNA-DNA杂交体上的RNA； ③具有DNA指导的DNA聚合酶活性，以逆转录合成的单链DNA为模板合成互 补DNA链。 逆转录酶对DNA没有3′ 5′外切酶活性，因此它没有校对功能，错 误率相对较高。 * * 核酸的体外扩增 第四章 第一节 聚合酶链反应 一、PCR技术简史 PCR的最早设想 核酸研究已有100多年的历史,20世纪60年代末、70年代初人们致力于研究基因的体外分离技术，Korana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想：“经过DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。 PCR的实现 1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis 等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。其原理类似于DNA的体内复制，只是在试管中给DNA的体外合成提供一种合适的条件：模板DNA 、寡核苷酸引物、DNA聚合酶、合适的缓冲体系，以及DNA变性、复性及延伸的温度与时间。 ???????????????????????????? PCR的改进与完善　Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 的Klenow片段，其缺点是：①Klenow酶不耐高温， 90℃会变性失活，每次循环都需要重新添加。②引物链延伸反应在37℃下进行，容易发生模板和引物之间的碱基错配，其PCR产物特异性较差，合成的DNA片段不均一。此种以Klenow酶催化的PCR技术虽较传统的基因扩增具备许多突出的优点，但由于Klenow酶不耐热，在DNA模板进行热变性时，会导致此酶钝化，每加入一次酶只能完成一个扩增反应周期，给PCR技术操作程序添了不少困难。这使得PCR技术在一段时间内没能引起生物医学界的足够重视。 　　1988年初，Keohanog改用T4 DNA聚合酶进行PCR，其扩增的DNA片段很均一