食品酶学-第5章.ppt

第五章酶催化反应动力学 ;第一节 酶反应速度的测定第二节 酶活力测定举例第三节 单底物酶促反应动力学第四节 多底物酶促反应动力学第五节 其它因素对酶促反应的影响 ;第一节 酶反应速度的测定;一、酶活力的测定;如何测定酶活力？;可见，反应速度只在最初一段时间内保持恒定，随着时间的延长，反应速度逐渐下降;1961年国际生物化学协会规定： 　　在最适反应条件下(温度25℃，其它条件如pH及底物浓度均采用最适宜的)，每分钟催化一微摩尔(1μmol)的底物转化为产物所需要酶量称为1个单位(U) 　　　　即：1U＝1μmol/min 人们常用习惯沿用的单位 　如：a-淀粉酶的活力单位规定为每小时催化1g可溶性淀粉液化所需要的酶量等 　　;酶的总活力：指样品的全部酶活力 　总活力=酶活力×总体积(mL) 　或　　=酶活力×总质量(g) 比活力：指酶纯度指标 　在固定条件下,每毫克酶蛋白所具有酶活力 (U/mg蛋白);二、酶活力的测定条件 ;第二节 酶活力测定举例 ;β-半乳糖苷酶的提取;酶活力(活性)的测定;1.????? 某无细胞提取液，每毫升含20mg蛋白质，在0.5ml的标准反应体系中，含有10μl这种提取液，在最适条件下，1min生成30nmol的产物。试计算： （1）??? 用下述单位表示反应速度υ： nmol·ml-1·min-1 nmol·L-1·min-1 μmol·L-1·min-1 mol·L-1·min-1 （2）??? 若10μl该提取液，在1ml总反应体积中进行试验，其反应速度是多少？ （3）??? 在反应混合液和提取液中酶浓度各是多少？ （4）??? 酶制剂的比活力是多少？;2. 有一骨骼肌无细胞提取液50ml，其蛋白质含量为32mg/ml，10μl提取液的反应速度υ＝0.14μmol/min。经40％饱和度的硫酸铵沉淀后，将沉淀溶于10ml水中，测得蛋白质浓度为50mg/ml，取10μl溶液，测得反应速度 υ＝0.65μmol/min。试问： （1）??? 经提纯后，酶的回收百分率是多少？ （2）??? 酶制剂的提纯倍数是多少？ ;第三节 单底物酶促反应动力学 ;(一) 酶反应速度与底物浓度的关系曲线;对于简单的酶反应，当酶浓度和其他条件恒定时：; 在酶浓度，pH，温度等条件不变的情况下研究底物浓度和反应速度的关系: 在低底物浓度时, 反应速度与底物浓度成正比，表现为一级反应特征。 当底物浓度达到一定值，几乎所有的酶都与底物结合后，反应速度达到最大值（Vmax），此时再增加底物浓度，反应速度不再增加，表现为零级反应。 ;(二) 米氏方程; 对于单底物、单产物反应，其反应过程需经过中间复合物ES，即 ; 1. 米氏方程的推导; 1. 米氏方程的推导; 2. 米氏方程中常数的意义;Km=;3、?? Km的物理意义 当反应速度v=1/2 Vmax时， Km = [S]， Km的物理意义是：当反应速度达到最大反应速度一半时底物的浓度。 单位：mol·L-1或mmol·L-1 Km是酶的特征常数之一。一般只与酶的性质、底物种类及反应条件有关，与酶的浓度无关。 ? ;Km与V的求取;双倒数作图法求取Km值举例;β-半乳糖苷酶的Km值及Vmax值;双倒数作图; 第四节 多底物的酶促反应动力学;（一）多底物酶促反应有 三种动力学机理;1、有序反应机理 只有领先底物A首先与酶结合，然后B才能与酶结合，形成的三元复合物EAB转变为EPQ，B 的产物P先释放，A的产物Q后释放。 ★在缺少A时，B不能与E结合;; 2、随机反应机理 底物A、B与酶结合的顺序是随机的，形成的三元复合物AEB → QEP，产物P、Q的释放顺序也是随机的。 ?; 3、乒乓反应机理;第五节 其它因素对酶促反应的影响 ;一、高浓度底物的抑制作用;二、抑制剂对酶促反应的影响;(1)不可逆抑制作用;(2)可逆抑制作用;竞争性可逆抑制; 竟争性抑制通常可以通过增大底物浓度来消除。 动力学：Vmax不变；Km值增加;这类抑制作用的特点是底物和抑制剂同时和酶结合，两者没有竞争作用 ; 动力学：Vmax减小，Km不变;酶只有与底物结合后，才能与抑制剂结合，即：ES+I→ESI，ESI P ;抑制剂只与酶－底物复合物结合； 抑制程度取决与抑制剂的浓度及底物的浓度； 动力学特点：Vmax降低，表观Km降低。;（3）可逆抑制作用与不可逆抑制作用的鉴别 通过透析、超滤、凝胶