第四章 PCR法获取目的基因.ppt

第四章 PCR法获取目的基因;目 录;DNA， 生命的蓝图;PCR技术;一、PCR技术的创建;Kary B. Mullis（1944－）;Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus，水生栖热菌 );二、 PCR技术的原理 ;1 PCR原理 （1）类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于寡核苷酸引物 （2）PCR过程：由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成 ①变性：94℃左右，使双链DNA模板解离成为单链； ②复性：55℃左右，引物与模板DNA单链互补配对结合； ③延伸：72℃左右，“模板-引物结合物”在DNA聚合酶作用下，以dNTP为原料，以靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成新的DNA链 （3）重复“变性--退火--延伸”的循环，可获得大量的新DNA链，而且这种新链又可成为下次循环的模板，从而指数级地获得大量DNA产物，数小时内可使目的基因的数量扩增数百万倍。;加热;3 PCR技术的特点;三、PCR的反应体系和条件;PCR技术的基本过程(1);PCR技术的基本过程(2);PCR技术的基本过程(3);注意事项;1）PCR反应成分;（2）引物（Primer） 浓度：0.1-0.5 ?mol/L，浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。 PCR反应产物的特异性由一对上下游引物所决定。引物的好坏往往是PCR成败的关键。引物设计可遵循下列原则： ①引物长度：约16-30bp，太短会影响引物与模板的配对； ②四种碱基随机分布，在3’端不存在连续3个G或C，这样易导致错误引发（false priming）； ③引物中G+C含量：通常为40-60%，可按下式粗略估计引物的解链温度——Tm＝4(G+C)+2(A+T)； ④引物3’端：关键碱基，必须与模板完全配对，最好对应密码子的第一或第二位核苷酸，以减少由于密码子摆动产生的不配对；; ⑤引物内部：尤其在3’端，不存在二级结构（Hairpin）、二聚体（Dimer）； ⑥两引物之间：尤其在3’端，不能互补以防出现引物二聚体（cross dimer），减少产量；两引物间最好不存在4个连续碱基的同源性或互补性； ⑦引物5’端：对扩增特异性影响不大，可在引物设计时加上限制酶位点、核糖体结合位点、起始密码子、缺失或插入突变位点以及标记生物素、荧光素、地高辛等。通常应在5’端限制酶位点外再加3-4个保护碱??； ⑧引物不产生false priming：不与模板结合位点以外的序列互补，避免错误引发PCR扩增。;（3）Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus) ①浓度：0.5-2.5 U/50 ?L体系，所用的酶量可根据DNA、引物及 其它因素的变化进行适当的增减，酶量增加使反应特异 性下降，酶量过少影响反应产量； ②Taq DNA聚合酶活性的半衰期：92.5℃ 130 min；95℃ 40 min；97℃ 5 min； ③Taq DNA聚合酶的酶活性单位定义：74℃下，30 min，掺入 10nmol/L dNTP到核酸中所需的酶量； ④Taq DNA聚合酶的出错率：一般PCR中出错率为1×10-5/ 每碱基对，在利用PCR克隆和进行序列分析时应注意。 ⑤类型：Taq DNA聚合酶:普通型，PCR产物末端为A； Pfu DNA聚合酶(Pyrococcus furiosus):高保真，出错率 为1×10-6/每碱基对PCR产物为平末端。;（4）反应缓冲液（PCR buffer） 组分：一般含10-50 mmol/L Tris?Cl (20℃下pH8.3-8.8)、50 mmol/L KCl和适当浓度的Mg2+； Tris?Cl：在20℃时pH为8.3-8.8，但在实际PCR反应中, pH为6.8-7.8； 50 mmol/L的KCl：有利于引物的退火； Buffer中加入5 mmol/L的二硫苏糖醇(DDT)或100 μg/mL的牛血清白蛋白(BSA)，可稳定酶活性； 加入T4噬菌体的基因32蛋白对扩增较长的DNA片段有利； 各种Taq DNA聚合酶商品都有自己特定的一些缓冲液。;（5） Mg2+;（6）dNTP（ 4种三磷酸脱氧核苷酸） 浓度：20-200μmol/L，dNTP浓度取决于扩增片段的长度，浓度过高易产生错误碱基的掺入,浓度过低则降低反应产量；理论上4种dNTP各20μmol/L, 就足以在100μL反应中合成2.6μg的DNA。当dNTP终浓度大于5