siglec-8介导柴朴汤对肝郁型哮喘eos凋亡的影响word论文.docxVIP

CUMSchronic unpredictable mild stress慢性不可预见性应激刺激SCTsucrose consumption test糖水消耗实验OFTopen field test开野活动度测试FSTforced swimmingtest强迫游泳实验Siglec-8介导柴朴汤对肝郁型哮喘EOS凋亡的影响研究生钟晴导师戴爱国教授目的：1、探讨柴朴汤对肝郁型哮喘大鼠EOS凋亡及siglec-8的影响2、探讨柴朴汤对人EOS凋亡及siglec-8的影响方法：1、柴朴汤对肝郁型哮喘大鼠EOS凋亡及siglec-8的影响。肝郁型大鼠模型的建立：取70只雄性SD大鼠（180g），随机分为对照组、正常中药组、哮喘组、哮喘治疗组、肝郁哮喘组、肝郁哮喘治疗组、地塞米松组。肝郁哮喘组、肝郁哮喘治疗组、地塞米松组三组大鼠于第1~28天进行慢性不可预见性应激刺激（CUMS），对照组、正常中药组、哮喘组及哮喘治疗四组则组不做任何处理。除对照组外的六组大鼠于实验第29天腹腔注射1ml抗原液（10mg OVA、100mg 氢氧化铝凝胶），再于实验第36天加强致敏。对照组则给予等量的生理盐水腹腔注射。在实验第43天，将6组大鼠置于雾化箱中，以1% OVA溶液雾化30 min，对照组则以生理盐水替代。用Buxco动物呼吸功能测定系统，测量各组大鼠气道阻力。HE染色观察气道病理改变。支气管灌洗液观察气道各炎症细胞比例。支气管灌洗液流式细胞计数观察EOS凋亡情况。Western-blot及Q-PCR检测siglec-8表达水平。2、柴朴汤对人EOS凋亡及siglec-8的影响。人EOS的提取：取外周血24ml，分装于4支50ml离心管中，加入五倍体积的红细胞裂解液。-20°C保存10min，于4°C500r离心8min。摒弃上清液，分别加入5ml2%HBS/Hanks液，混匀后收集与同一离心管4°C 500r离心8min，摒弃上清液，加入1ml2%HBS/Hanks和1mlFMLP，37°C水浴10min。取一支15ml离心管，按顺序分别加入75%70%65% 和53%的percoll分离液。缓慢加入水浴后的白细胞重悬液，4°C 2400r离心20min。缓慢吸取70%percoll分离液上层的分离液。其余分离液加入3倍体积1*PBS，4°C 2400r离心10min，摒弃上清液，反复三次后将分离出的EOS 于10%HBS/RPMI1640中培养。柴朴汤制配：柴胡42g，半夏36g，茯苓54g，黄芩18g，厚朴18g，大枣18g，人参1.8g，甘草12g，苏叶12g，生姜6g。所需生药煎煮三次，第一次1.5小时，第二、三次每次1小时，合并三次药液后加入适量85%乙醇沉淀，去沉淀取上清液，过滤，回收乙醇，消毒浓缩，最终每毫升药液中含生药1.0g。含药血清的制配：180g雄性SD大鼠10只柴朴汤灌胃，每日早晚各一次，每次4ml,连续10天。与最后一天灌胃后1h腹主动脉取血，离心后取上层血清，56°C灭活30min。-20°C保存备用。将提取的EOS放入含5%，10% 及20%的含药血清中，于37℃培养箱中孵育1h后提取蛋白质及RNA，Western-blot及Q-PCR检测siglec-8表达水平。结果：1、肝郁模型的建立与评价，相对于对照组，肝郁模型组大鼠体重变化低于对照组，糖水消耗量低于对照组，开野活动水平及垂直活动次数低于对照组，强迫游泳不动时间高于对照组，其差异均具有统计学意义（P＜0.01）。2、哮喘模型的建立，相对于对照组，哮喘组与肝郁型哮喘组大鼠出现呼吸频率加快、节律不齐、点头样呼吸，发绀，烦躁不安，其毛发无光泽，说明哮喘激发成功，肺功能测定哮喘组和肝郁哮喘组气道阻力高于对照组（P0.01）。肺组织HE染色显示哮喘组：气道及周围组织可见炎性细胞浸润，上皮细胞水肿、脱落；支气管黏膜及平滑肌增生，部分可见平滑肌破坏断裂。肝郁哮喘组：气道黏膜及平滑肌严重增生；可见平滑肌破坏断裂，小气道闭塞，炎性细胞浸润，肺泡呈扩张态并可见渗出物。支气管肺泡灌洗液细胞分类计数炎症细胞总数哮喘组与肝郁哮喘组分别为（78.00±6.88）×107/L、（89.5±3.69）×107/L，嗜酸性粒细胞比例（23.32±3.59）%、（30.79±4.62）%，均高于对照组（33.00±2.58）×107/L、（0.77±0.22）%（P0.01），其中肝郁哮喘组炎症细胞总数与嗜酸性粒细胞比例高于哮喘组（P0.01）。肺功能测定肝郁哮喘组与哮喘组的气道阻力均高于对照组（P0.01），其中肝郁哮喘组高于哮喘组（P0.01）。肺组织HE染色可见哮喘组：支气管粘膜及平滑肌增生，可见平滑肌断裂，气道周围可见多种炎症细胞浸润，以嗜酸性粒细胞为主，上皮细胞水肿。肝郁哮喘组：部分小