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siRNA沉默Twist基因对Caski细胞化疗增敏的研究中文摘要背景：胚胎发育基因Twist 属于高度保守的碱性螺旋-环-螺旋（basic helix-loop-helix，bHLH）结构的转录因子家族, 具有癌基因的特征, 不仅参与肿瘤的发生、发展，而且与肿瘤细胞对化疗不敏感、产生耐药性密切相关。肿瘤细胞出现化疗敏感性降低、产生耐药现象是肿瘤临床化疗效果不佳的关键性问题，明确其中可能的原因及机制对提高临床化疗疗效具有深远的意义。因此，本课题主要研究了沉默Twist基因增加了宫颈癌细胞对紫杉醇的化疗敏感性，为提高宫颈癌化疗疗效以及其临床治疗效果提供新思路。目的：沉默宫颈癌细胞中的Twist基因，并予紫杉醇预处理，研究其增殖、克隆、凋亡、细胞周期的情况，揭示沉默Twist基因是否可提高宫颈癌细胞化疗敏感性。方法：1、体外培养宫颈癌Caski细胞和Hela细胞，用半定量PCR及荧光定量PCR检测两种细胞中Twist基因mRNA的表达，筛选出表达高者为合适的实验细胞株模型；2、设计并化学合成两对靶向Twist基因的siRNA(siRNA1、siRNA2)及一对与任何基因无同源性的阴性对照siRNA（NC），利用LipofectamineTM2000将各组siRNA转入宫颈癌Caski 细胞中，荧光定量PCR检测Twist mRNA表达，筛选出沉默Twist 基因效果最佳siRNA；3、瞬时转染Caski细胞，予0.001、0.01、0.1、1、10umol/L5种不同浓度紫杉醇溶液作用，MTT 法检测细胞增殖情况及半数抑制浓度(IC50)；克隆形成实验检测克隆形成能力；流式细胞学术检测细胞凋亡和细胞周期情况。结果：1、Caski 细胞中Twist基因表达较Hela细胞中高，其差异具有显著性（p0.05）。2、在36h、48h、60h不同时间点，转染siRNA1、siRNA2的两组Caski细胞中Twist mRNA表达抑制率分别为20.3%、38.2%、33%；24%、68.6%、50.8%。转染siRNA1、siRNA2 组的RQ 值较阴性对照组明显降低，尤以siRNA2 组显著（p0.01），且在转染48h 明显，其差异有统计学意义（p0.05）。3、在5 种不同浓度紫杉醇作用48h 后，转染效率最佳的siRNA2组(记为si-Twist 组)细胞生长抑制率明显高于阴性对照组(NC-Twist 组)及空白对照组(Mock组)，且生长抑制率呈浓度依赖性（p0.05）；si-Twist组、NC-Twist组、Mock组各组半数抑制浓度(IC50)分别为1.00±0.13umol/L、32.82±3.25umol/L、48.33±3.54umol/L，si-Twist组IC50值明显低于其他两组（p0.05）；在1umol/L（IC50）紫杉醇作用各组Caski细胞不同时间后，si-Twist 组细胞生长抑制率明显高于NC-Twist组及Mock组，以作用24-48h 显著（p0.05）。4、1umol/L紫衫醇作用后，si-Twist组、NC-Twist组克隆形成率分别为8.20±0.71％、21.00±2.12％，si-Twist组克隆形成能力明显低于NC-Twist组，其差异具有统计学意义（p0.05）。5、1umol/L紫衫醇作用后, si-Twist 组、NC-Twist组凋亡率分别为43.21±6.19％、26.16±5.89％，si-Twist 组凋亡率明显高于NC-Twist 组，其差异显著（p0.05）；si-Twist组细胞周期分布G0/G1期、S期、G2/M期分别为56.50±6.33%、21.59±2.54%、21.90±3.71%，NC-Twist 组细胞周期分布G0/G1期、S期、G2/M 期分别22.70±3.48%、29.12±1.55%、48.18 ±3.97%,沉默Twist基因组细胞周期以G0/G1期阻滞为主（p0.05）。结论：1、Twist 基因在Caski细胞株中高表达。2、沉默Twist 基因，可抑制Caski 细胞增殖及克隆形成能力，促进其凋亡，从而提高Caski 细胞的化疗敏感性。关键词：宫颈癌Caski 细胞小干扰RNA 化疗敏感性AinvestigationofsilencingTwistgenebysmallinterferingRNAenhancedchemosensitivityinCaskicellsAbstractBackground:TheembryodevelopmentgeneTwist,belongingtothefamilyof basichelix-loop-helixstructure,isahighlyconservedtranscription