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白花舌蛇草逆转乏氧HepG-2细胞对ADM的耐药性中文摘要目的建立乏氧HepG-2 细胞模型，明确其对ADM 具有耐药性。探讨白花蛇舌草是否能够逆转乏氧HepG-2 细胞对ADM 的耐药性，并进一步探讨其可能的分子机制。方法台盼蓝拒染色法观察CoCl2作用后HepG-2 细胞的存活率；MTT法测定白花蛇舌草对乏氧HepG-2细胞的抑制率；MTT法分别测定阿霉素作用于普通HepG-2 细胞以及乏氧HepG-2细胞的IC50 值，并计算其耐药倍数（耐药细胞组的IC50/ 敏感细胞组的IC50）；MTT法测定白花蛇舌草作用于乏氧HepG-2细胞后对阿霉素的IC50 值，并计算其耐药逆转倍数（未加逆转剂组的IC50/加逆转剂组的IC50）；流式细胞术（FCM）检测细胞的凋亡率；Western Blot 检测细胞内HIF-1a、P-gp 及MRP蛋白的表达。结果1.含100 umol/L的CoCl2培养基培养HepG-2细胞可建立乏氧HepG-2细胞模型。用0-200umol/L不同浓度的CoCl2作用于HepG-2 细胞4 天，100umol/L以上浓度的CoCl2在培养至第3 天时可使细胞40%以上全部死亡，而小于该浓度则细胞存活率可达到90%。因此，选用细胞最大的耐受剂量100umol/L浓度的CoCl2 做为我们后续实验的用药剂量。2.CoCl2诱导的乏氧HepG-2 细胞中HIF-1a 的表达量增加。WesternBlot结果发现，用100 umol/L的CoCl2建立的乏氧HepG-2 细胞中HIF-1a蛋白的表达量明显高于普通HepG-2 细胞(P0.01)，并且其表达量具有时间依耐性。3.乏氧HepG-2 细胞对比普通HepG-2 细胞无明显形态学改变。将分别用普通培养基和含100umol/L的CoCl2培养基培养72 小时后所得的HepG-2 细胞和乏氧HepG-2 细胞，进行瑞氏-吉姆萨染色，置于倒置显微镜下观察发现，两种细胞之间并无明显形态学差异。2.白花蛇舌草对乏氧HepG-2 细胞的最大无毒剂量。设置25、50、75----250mg/L共10 个白花蛇舌草浓度梯度分别作用于乏氧HepG-2 细胞，采用MTT 法计算白花蛇舌草对乏氧HepG-2 细胞的抑制率，并绘制出浓度作用曲线。选择对细胞抑制率低于5%的25mg/L（最大无毒剂量）的白花蛇舌草作为后续实验浓度。.白花蛇舌草能够部分逆转乏氧HepG-2 细胞对ADM的耐药性。5.1白花蛇舌草能降低乏氧HepG-2细胞对ADM的IC50值。MTT法结果显示：ADM 作用于乏氧HepG-2 细胞48h 后的IC50值为19.21±0.32mg/L，明显高于普通HepG-2 细胞的IC50 值2.31±0.23mg/L(P0.001)。而加入白花蛇舌草后IC50 值降为7.27±0.41mg/L，对比乏氧HepG-2细胞组有显著性差异(P0.01)，耐药倍数和逆转倍数分别为8.32 倍和2.64 倍。说明乏氧HepG-2 细胞对ADM具有耐药性，而白花蛇舌草能够部分逆转其耐药性。5.2 白花蛇舌草能够加重ADM对乏氧HepG-2 细胞的毒性作用。2.5 mg/LADM作用于三组细胞：HepG-2细胞、乏氧HepG-2 细胞和白花蛇舌草+乏氧HepG-2 细胞48 小时，流式细胞仪测得凋亡率分别为58.20± 3.76%、10.05± 1.25%和25.42±2.34%。说明白花蛇舌草能够部分逆转乏氧HepG-2 细胞对ADM 的耐药性，加重ADM 的细胞毒性作用。.白花蛇舌草逆转乏氧HepG-2 细胞对ADM的耐药性可能与其下调HIF-1a、P-gp、MRP蛋白的表达有关。Western-blot 结果显示乏氧HepG-2 细胞对比HepG-2 细胞，其HIF-1a、P-gp 和MRP蛋白表达量均明显增加(P0.01,P0.01,P0.001)，而加入白花蛇舌草后，则能明显减少其蛋白表达量(P0.05,P0.05,P0.05)。说明HIF-1a、P-gp 和MRP 蛋白可能参与了乏氧HepG-2 细胞对ADM 的耐药性，而白花蛇舌草通过下调这三种蛋白来逆转其耐药性。结论1.CoCl2诱导的HepG-2乏氧细胞模型对ADM具有耐药性，而白花蛇舌草能够部分逆转其耐药性。2.白花蛇舌草逆转乏氧HepG-2细胞对ADM的耐药性可能与其下调HIF-1a、P-gp、MRP蛋白的表达有关。3关键词肝癌；乏氧；耐药性；白花蛇舌草4DrugresistancereversingeffectsofChinesemedicineHedyotisdiffusaonhypoxicHepG-2cellsAbstractObjectiveTo establish hypoxic HepG-