[基础科学]蛋白质工程.ppt

X-ray研究蛋白質的3-D結構 第一节　医用抗体的蛋白质工程(续) II. 从抗血清到重组抗体 III. 抗体工程 1). 鼠-人嵌合抗体 2).来自鼠抗体可变结构域骨架区可被人源化 3). 抗体的三维结构可在计算机上建模 第一节　医用抗体的蛋白质工程 I. 抗体的产生和抗体的结构简介 1). 多肽组件的随机组合产生大量不同抗体 2). 抗原结合的特异性由超可变结构域决定 3). 恒定区的作用是稳定抗体分子 4). 稳定区介导效应器功能 第二节　组织纤维蛋白溶酶原激  活因子的蛋白质工程 I. 有关重组t-PA II. 产生t-PA突变体的基本原理 III. t-PA蛋白质工程的几个方面 1). 减慢清除的t-PA变体 2). 血纤维特异性 1990年Mc Cafferty等成功地建立了噬菌体表面展示系统，通过将抗溶菌酶单链抗体基因克隆于fd噬菌体基因3的下游，使ScFv以融合蛋白的形式展示于噬菌体表面，利用亲和层析，两轮富集达106倍。该技术的成功给抗体基因的筛选工作带来了革命性的变革。 噬菌体表面展示系统(phage surface display system ) 噬菌体表面展示文库技术的要点: 外源基因表达多肽以融合蛋白形式展示在外壳蛋白N端 将基因组合文库插入噬菌体编码膜蛋白的基因 g3或g8 的先导系列的紧靠下游 随机克隆入相应载体形成组合文库 从免疫或未被免疫的B细胞中PCR扩增抗体全套基因片段 用固相化抗原经“亲和结合一洗脱一扩增”数个循环直接、方便、简捷、高效地筛选出表达特异性好、亲和力强的抗体噬菌体库。 使翻译出的抗体分泌到细菌的质周腔内，形成游离的抗体片段，经过纯化即可获得目的抗体。 筛选到的噬菌体再将基因g3或g8切除后，转入大肠杆菌， 该项技术的优点: 将抗体的基因型和表型紧密联系起来; 可绕过杂交瘤技术，不需要复杂的基因工程技术; 抗体基因筛选的范围广; 技术稳定、可靠、生产周期短;可规模化生产; 适用范围广，既可用于抗体制备，也适用于其它蛋白如激素、酶、药物、随机多肽等的生产。 噬菌体抗体库技术的发展具有很大优越性。它简单易行，筛选容量大，效率高，绕过了细胞融合及免疫等步骤，而且在表型一基因型的统一和识别一增殖过程上模拟了B细胞的成熟过程，从而在实际应用上具有很大意义。 6 转人Ig基因小鼠 获取人Ig基因：构建人Ig的YAC文库及筛选 小鼠胚胎干细胞培养 小鼠内源性Ig基因的敲除 获得完整人Ig-YACs克隆 Ig-YACs克隆小ES细胞的导入 含人Ig-YACs的ES细胞移入小鼠胚胎 含人Ig-YACs的ES细胞的小鼠胚胎向小鼠体内送还嵌合 纯合小鼠的产生和鉴定 纯合小鼠制备特异性完全人源化抗体 * x-ray照射結晶，產生布拉格繞射，得到繞射分析圖 振幅amplitude 相角α 由電腦分析繞射圖，可得繞射波的強度Ｉ ＋ 結構因子F (structure factor) 經過Forier 變換之後 多張電子密度圖(electron density map)比較 1 人一鼠嵌合抗体(Chimeric Antibodies) 人一鼠嵌合抗体是将鼠源单抗的可变区与人抗体的恒定区融合而得到的抗体。 构建嵌合抗体的大致过程是，将鼠源单抗的可变区基因克隆出来，连到包含有人抗体恒定区基因及表达所需的其它元件(如启动子、增强子、选择标记等)的表达载体上，在哺乳动物细胞(如骨髓瘤细胞、CHO细胞)中表达。 构建重组表达载体 克隆鼠单抗的可变区基因，可从基因组文库中分离，也可用PCR技术分离。 人抗体恒定区可根据需要选择，不同的恒定区会带给嵌合抗体不同功能。为避免人抗体的恒定区产生不需要的副作用，可通过点突变来修饰调整其效应。 人一鼠嵌合抗体与鼠单抗相比，免疫原性大大降低，利于在人体内应用，所以目前已制备出上百种抗各种抗原(包括肿瘤相关抗原)的嵌合抗体。 2 鼠单抗可变区的人源化 尽管嵌合抗体的免疫原性已降低很多，但有时它仍可能引发较强的免疫反应。为了进一步降低抗体的鼠源成分，发展出CDR移植技术。 CDR即互补决定区。Ig超变区氨基酸残基的种类和顺序特别多变，这些部位与识别抗原直接相关，为Ig分子的抗原结合部位，故称为互补决定区。 CDR移植即把鼠抗体的CDR序列移植到人抗体的可变区内，所得到的抗体称CDR移植抗体或改型抗体，也就是人源化抗体。 经过CDR移植，抗体的免疫原性极低，而其抗原结合能力保持不变，结合半抗原及全抗原(如细胞表面受体、病毒等)的改形抗体都已有报道，到现在已有数百种人源化抗体。（美国正式上