针对如上现状本课题拟解决以下几个主要问题分离人骨髓msc进行.docVIP

研究BMP-2对骨髓间充质干细胞促进造血干细胞增殖的影响 李晓明 [摘要] 目的：通过非接触共培养HSC与MSC，并用rhBMP-2干预，在第三天时检测HSC的增殖，可以探讨MSC和BMP-2对HSC增殖的影响以及BMP-2如何调节MSC对生存在骨髓微环境即微龛（niche）中的造血干细胞（HSCs）为所有成熟血细胞的原始造血细胞由于在骨髓中CD34抗原主要存在于幼稚造血干/祖细胞(HS/PC)、极少量骨髓基质细胞和内皮细胞的表面，故CD34抗原是造血干/祖细胞的重要标志，我们常用此抗原分选HSC。MSC)是微龛中的重要干细胞，具有贴壁性；表达CDl05、CD73、CD90一些特定的表面抗原，不表达CD45、CD34、可以向成骨细胞、内皮细胞等各种细胞分化。微龛极其复杂，由基质细胞及其前体间充质干细胞（MSCs）、细胞因子、细胞外基质等组成。niche主要分为“成骨微龛”和“血管微龛”，前者主要维持HSC静息状态，后者可以调节HSC增殖、分化、迁移等。目前关于MSC对HSC增殖影响的研究较多骨形态发生蛋白（BMP)-2在造血调控中起重要作用。作为重要的成骨因子可刺激MSC分化为成骨细胞，构成“成骨niche”的主体结构，还能促进血管的形成，关于它在成骨niche中的研究较多，而其在血管niche方面的作用研究较少。目前关于MSC促进HSC增殖的研究较多，而关于BMP-2对MSC促进HSC增殖的影响的研究较少。 材料与方法 1.骨髓来源 骨髓取自。骨髓采集经伦理委员会批准授权，抽取适量骨髓至肝素钠离子抗凝管，充分混匀，均在半小时内使用。 主要实验试剂LG-DMEM培养基青霉素-链霉素0.25%胰蛋白酶美国Gibco公司ECD标记的小鼠抗人CD34FITC标记的小鼠抗人CDl05PEcy7标记的小鼠抗人CD45鼠抗人IgG抗体美国Pharmingen公司人CD34+细胞选择试剂盒miniMACS磁珠分选分离装置中号分离柱子Mitenyi Biotec公司重组人干细胞因子无菌PBS稀释浓度为200ng/ml，混匀后分装-20℃保存重组人白介素-3 PBS稀释浓度为00ng/ml，混匀后分装-20℃保存重组骨形态发生蛋白-2PBS稀释浓度为/ml，混匀后分装-20℃保存RD公司引物 上海生工生物工程股份有限公司反转录试剂盒子日本TOYOBO公司PCR试剂盒德国QIAGEN公司TRIZOL试剂盒美国Invitrogen 公司24孔transwell小室美国Costar公司 1.3 MSCs的体外培养及鉴定 ECD标记的小鼠抗人CD34FITC标记的小鼠抗人CDl05PEcy7标记的小鼠抗人CD45ECD、FITC、PE标记的鼠抗人IgG抗体骨髓CD34+胞分离及鉴定 1.5共培养及MSC和BMP-2对HSC增殖的检测（实验设计见下示意图） 在共培养时每孔总体积700ul，104个HSC/孔，3×105个MSC/孔，含IL-3浓度为10ng/ml、72小时时收集样本。 计数板计数各组HSC的数目（图A） 用98%乙醇浸泡计数板和盖玻片，并用脱脂棉擦拭。用加样枪吸取10ul细胞悬液，让加样枪的枪头在盖玻片下侧的计数板凹蹧处流出悬液，至凹槽被液体充满为止。显微镜下计数四角大方格内的细胞总数，压线细胞只计左侧和下方。计算公式：细胞数目/ml=四角大方格内的细胞总数/4×104。 实时荧光定量qRT-PCR 引物用PBS溶解成100uM浓度后分装，-20℃避光保再稀释10倍β-actin 5’-AGAGATGGCCACGGCTGCTT-3’，5’-ATTTGCGGTGGACGTGGAG-3’ ；Ki-67 5’- CAAGCCACAGTCCAAGAGAA ，5’- GTGTCCATAGCTTTCCCTACTG-3’。将收集的第3天的HSC的各样本用Trizol法提取RNA,用分光光度计测量RNA的浓度、A260和A280的值。将RNA稀释后，模板量均取1ng，经逆转录酶转录成cDNA。再以cDNA为扩增模板，应用荧光定量qRT-PCR法检测各组CD34+细胞的Ki67的mRNA,共40个循环。每个实验组种3复孔，将β-actin 设为内参基因，计算Ct值，并用2-△△Ct法分析。 数据统计 以上步骤中所得数据均采用SPSS17.0 统计学软件进行处理，计量资料以“均数±标准差(±SD)”表示，两组间数据比较采用单因素方差分析，若方差不齐，采用LSD-t检验，