[医药]流式细胞仪分析技术与应用.pptVIP

第十七章 流式细胞仪分析技术及应用 第一节 概述 一、工作原理 二、散射光的测定 三、荧光测量 四、细胞分选原理 第二节 数据的显示与分析 一、参数 二、数据显示方式 三、设门分析技术 第三节 流式细胞仪免疫分析的技术要求 一、免疫检测样品制备 二、免疫分析中常用的荧光染料与标记染色 三、免疫胶乳颗粒的应用 四、流式细胞免疫学技术的质量控制 第四节 流式细胞术在免疫学检查中的应用 一、淋巴细胞及其亚群的分析 二、淋巴细胞功能分析 三、淋巴造血系统分化抗原及白血病免疫分型 四、肿瘤耐药相关蛋白分析 五、AIDS病检测中的应用 六、自身免疫性疾病相关HLA抗原分析 七、移植免疫中的应用 思考题 小结 流式细胞术(flow cytometry, FCM)是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选的新技术。 流式细胞术最大的特点是能在保持细胞及细胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状态下，通过荧光探针的协助，从分子水平上获取多种信号对细胞进行定量分析或纯化分选。 细胞不被破坏，测量快速、大量、准确、灵敏、定量 流式细胞术的特点 流式细胞仪是测量染色细胞标记物荧光强度的细胞分析仪，是在单个细胞分析和分选基础上发展起来的对细胞的物理或化学性质（如大小、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等）进行快速测量并可分类收集的高技术。 第一节 概述 细胞组成 细胞功能 大小 细胞表面/胞浆/核--特异性抗原 粒度 细胞活性 DNA, RNA含量 胞内细胞因子 蛋白质含量 激素结合位点 钙离子, PH值, 膜电位 酶活性 流式细胞仪常检测的细胞特性 采用激光作为激发光源，保证其具有更好的单色性与激发效率； 利用荧光染料与单克隆抗体技术结合的标记技术，保证检测的灵敏度和特异性； 用计算机系统对流动的单细胞悬液中单个细胞的多个参数信号进行数据处理分析，保证了检测速度与统计分析精确性。 一、工作原理 （1） 液流系统 （2） 光学系统 （3） 数据处理系统 1.流式细胞仪的基本结构： 由样本和鞘液组成 待测细胞 单个细胞的悬液 荧光染料标记的单抗对其染色 受清洁气体压力 从样品管进入流动室形成样本流 鞘液：辅助样本流被正常检测的基质液。主要作用是包裹样本流的周围，保持样本流中细胞处于喷嘴中心位置，防止其靠近孔壁而阻塞喷孔。 （1）液流系统 液流系统示意图 FCM的液流系统（如何形成单个细胞流） 样本管 鞘液管 激光光源：气冷式氩离子激光器 分色反光镜：反射长/短波长，通过短/长波长 光束成形器：两十字交叉放置的透镜 透镜组：形成平行光，除去室内光 滤片：长通、短通、带通 光电倍增管：FS, SS（散射光）， FL1, FL2, FL3, FL4（荧光） （2）光学系统 光学系统示意图 主要由计算机及其软件组成 （3）数据处理系统 基本工作原理 基本过程 区别 流式细胞仪 显微镜 光源 激光 自然光、灯光 对象 细胞、生物粒子 细胞、组织等 承载工具 鞘液及流动室 载玻片 检测信号 光学信号 形态及染色 放大方式 PMT、放大电路 目镜×物镜、光学放大 统计 计算机，5000 人工，200 结果 多参数，综合分析 简单，单参数 流式细胞仪与显微镜的区别 细胞在液柱中与激光束相交时向周围360°立体角方向散射的光线信号，它的强弱与细胞的大小、形状、胞内颗粒折射等有关，主要分为前向散射光和侧向散射光。 二、散射光的测定 前向散射光（forward scatter, FS）：激光束照射细胞时，光以相对轴较小角度(0.5°～10°)向前方散射的讯号用于检测细胞等粒子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。 前向散射光示意图 侧向散射光（side scatter, SS）：激光束照射细胞时，光以90°角散射的讯号，用于检测细胞内部结构属性。 侧向散射光示意图 测得的FS与SS信号通过计算机处理，可得到FS-SS图，由此可仅用散射光信号对未染色的活细胞进行分析或分选。 此为血细胞分类的基本原理，但不能分析表面分子。 淋巴细胞 单核细胞 中性粒细胞 光散射测量最有效用途：从非均一群体中鉴别出某些亚群 荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料受激发后产生，发射的荧光波长与激发光波长不同。 每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色，通过波长选择通透性滤片，可将不同波长的散射光和荧光信号区分开，送入不同的光电倍增管。 选择不同的单抗及染料就可同时测定一个细胞上的多个不同特征。 线性放大器和对数放大器 三、荧光测量 荧光染料的特性 激发波长(EX