[医药卫生]蛋白质组学的研究.ppt

蛋白组学研究 制作：第五组全体组员 网络药理学的研究方法 　一、蛋白质组学研究背景 “proteome”(蛋白质组)一词由澳大利亚Macquaie大学的Marc Wilkins于1994年首次提出。 2001年2月，Nature和Science杂志在公布人类基因组序列草图的同时，分别发表了“And now for the proteome”和“Proteomicsin genomeland”的述评与展望，对蛋白质组学研究发出了时代性呼唤。 2 0 0 1 年，国际人类蛋白质组组织( H u m a nProteome Organization, HUPO)成立，提出了人类蛋白质组计划（HPP)，(/)。众多国家和地区成立蛋白质组学术组织并踊跃参与国际计划。 二、研究目的 蛋白质组学是识别及鉴定蛋白质以及其表达模式，是发现大量新型生物标志物、药靶和药物的重要途径，已经成为世界各国奋力抢占的战略制高点。 三、蛋白组学研究对象 以蛋白质组为研究对象，分析细胞内动态变化的蛋白质组成成分、表达水平与修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用与联系，在整体水平上研究蛋白质的组成与调控的活动规律。 蛋白质组学运用“一网打尽”的“组学”研究模式，与以往研究单个蛋白质的“钓鱼”模式有所不同。 四、研究范围 五、蛋白质组研究技术体系总流程图 样品制备的一般过程 样品制备直接影响到蛋白质组研究结果.对于一些特殊的蛋白质处理如下： 溶解度差的蛋白质, 如膜蛋白、与膜相连的蛋白质以及来自具有高抗性组织 ( 头发、皮肤等等) 的蛋白质, 需要添加破膜剂、兼性离子表面活性剂等以增加蛋白质的溶解度, 提高蛋白质的提取率. 有报道采用有机溶剂提取亲脂性蛋白;或采用不同溶出缓冲液多步提取各种膜蛋白. 蛋白组学核心技术 双向凝胶电泳 双向凝胶电泳研究程序 判断双向凝胶电泳的好坏通过分析其图谱而获得. 一张好的图谱必须低背景、少纹理、分辨率高、灵敏度高, 而且图谱之间必须存在良好的重现性. 双向凝胶电泳蛋白质点的矢量图 ( vector map of the 2-D gel)是专门用来研究蛋白质翻译后是否修饰的一种方法, 通过此法能了解蛋白质翻译后修饰程度. 质谱鉴定技术 电喷雾电离 ( ESI)  ESI 技术已经 运 用 到 四 极 杆 质 谱、飞 行 时 间 质 谱( T OF ) 、离子阱质谱 ( IT M S) 和傅里叶变换离子回旋加速器质谱 ( FT MS) , 但还不能用于磁质谱中. ESI 作为液相进样, 它可以与高效液相色谱( H PL C) 、毛细管电泳 ( CE) 等技术相连. 双向凝胶电泳分离直接导入带有 ESI 的串联质谱 ( MS/ MS) 分析仪中: HPLC-MS/ MS 适合含10 pmol 以上的肽样品; 毛细管 HPL C- MS/ M S 适合含几个皮摩尔到几十个飞摩尔肽样品; CE-MS/M S 适合含飞摩尔或更低肽样品, 此仪器灵敏度最高. LC-MS/ MS 已经实现了自动化; 固相提取毛细管区带电泳与串联质谱联用初步实现自动化 基质辅助激光解吸电离 ( MALDI)  MAL DI 常与飞行时间质谱 ( TOF-MS) 联用, 称为基质辅助激光解吸电 离飞行时 间质谱 ( MALD-ITOF-M S) . 目前蛋白质的肽指纹谱 ( peptide fingerprinting, PMF ) 测 定 常 用MALDI- T OF- M S, 也有用 ES-I MS. 这两种方法精确度高, 均可达 011 个质量单位; 灵敏度高, 分解亚皮摩尔量的蛋白质, 所产生的小肽段, 也可以做质谱 分 析; 分 析 时 间 短, 测 定 仅 需 几 分 钟. 例如： MALD-I T OF- M S 测定蛋白质肽指纹谱已经实现了高度自动化集成系统在不到 10 个工作日内鉴定了大肠杆菌双向凝胶上 95 个蛋白质点. 目前, 有两种分离、鉴定蛋白质的方法类似于双向凝胶电泳:一种是采用双向高效液相与质谱联用来鉴定蛋白质质谱数据的数据库检索: 三条有 4~ 6 个肽段质量肽段便可用来鉴定蛋白质,根据所测数据, 可采用不同的软件检索: P ept ideSearch、 T agIdent、 M ass Search、 Ms-F it、 P roFound、 M -s Edman、 MOWSE、 Ms-T ag、PepFrag、Sequest、MutiIdent . 另一种是采用等电聚焦-固相 pH 梯度 ( IEF-IPG) 作为第一向，分离质谱测定分子质量作为第二向. 综上所述：质谱鉴定蛋白质, 其优点是灵敏度高、准确度高, 而且容易实现自动化. 因此, 质谱技术是