血小板减少症患者TPO、IL-11调控机制的研究课件.pptVIP

血小板减少症患者TPO、IL-11调控机制的研究 研究工作报告 一、立项依据,研究目标及主要研究内容 立项依据 血小板减少症在临床很常见。严重的血小板减少可危及患者生命，长期以来尚无特效的药物治疗。输注血小板除价格昂贵，维持时间短暂外，还不可避免地增加了血源性感染，输血反应和产生抗血小板抗体的发生率，致使某些患者“无效输注”。因此对一部份血小板减少症的处理是困扰临床医生的一项难题。迫切希望能寻找一种更好的治疗方法。 导致血小板减少的原因众多，原发性血小板减少性紫癜（ITP）临床上多种诊断依据均无特异性，而继发性血小板减少症有部分原因很难明确。目前研究认为血小板生成素(TPO)和白细胞介素-11(IL-11)是参与巨核细胞、血小板调控的主要细胞因子。因此对血小板减少症患者TPO、IL-11调控机制的深入研究，将对血小板减少症的诊断和治疗具有重要的临床意义。 研究目标 通过研究深入了解不同原因血小板减少症患者血清IL-11, TPO及其受体c-mpl基因水平表达，观察IL-11治疗前后TPO及其受体c-mpl的变化。以进一步探讨血小板减少症患者TPO、IL-11的调控机制，为临床诊断、治疗血小板减少症提供新的理论依据。 主要研究内容 血小板减少症患者血清TPO及其受体c-mpl表达的研究采用酶标记免疫法检测不同原因血小板减少症患者血清TPO水平，采用分子克隆技术、RT-PCR技术检测血小板减少症患者血小板上TPO受体c-mpl基因表达，探讨不同血小板减少症患者TPO及其受体c-mpl表达的临床意义及调控机制。 血小板减少症患者血清内源性IL-11水平检测及意义应用酶标记免疫法检测不同原因血小板减少症患者血清IL-11水平，分析它们与外周血小板计数之间的关系，探讨其血小板减少症患者血清内源性IL-II的临床意义及调控机制。 观察急性白血病患者应用rhIL-11治疗前后血清TPO及其受体c-mpl的变化应用酶标记免疫法、分子克隆技术、实时定量PCR技术检测急性白血病患者应用IL-11治疗前后患者血清TPO及其受体c-mpl表达的变化。对血小板减少症患者TPO、IL-11调控机制进行深入研究探讨。 二、 血小板减少症患者TPO、IL-II调控机制的研究 第一部分 实验方法 一、双抗体夹心酶联免疫吸附方法（sandwich-ELISA）：采用人TPO、IL-11定量EIA试剂盒。参照说明书进行操作 二、半定量RT-PCR法。 （一）总RNA的提取：采用小量血液总RNA快速抽提纯化试剂盒DNase Ⅰ、RNase out 参照说明书进行操作 （二） 总RNA的测定：取3μl总RNA加入90μl纯水，吸光度扫描计算总RNA浓度并估算其纯度，波长260nm与280nm处的吸光度比值为1.8－2.0 。 （三）总RNA全部逆转录为总cDNA采用Accesss RT PCR System 总RNA 0.6μg 5╳ RT Buffer 2μl 10 mmol／L dNTP 1μL oligoDT 0.5μL random primer 0.5μL AMV（2000μ／μL） 0.5μl MgSO4 2μL 加ddH2O至总体积50μL （四） PCR反应：采用筑巢PCR PCR引物 根据c-mpl基因的第十二外显子序列设计二对引物：由上海博亚生物技术有限公司合成。 第一对M：上游引物为 5’－GGCTGAGTCAGGGTCCTG－3’ 下游引物为5’－GCGAGATCAAAGGAACTGATG－3’ 扩增片断长度484bp 第二对m：上游引物为5’－CAGTTCCCTGGACAGAGC－3’ 下游引物为5’－GACATCAAAGAGGAGAGAGG－3’ 扩增片断长度213bp；其中带有XhoⅠ限制性内切酶位点。 内对照β-actin基因引物：昆明医学生物研究所疫苗研究室提供 上游引物为5’－GTGGGGCGCCCCAGGCAC－3’ 下游引物为5’－CTCCTTAATGTCACGCACGAT－3’ 扩增片断长度548bp 扩增的序列为： gg ctgagtcagg gtcctgctgt accacccaca ttgccaacca ttcctaccta ccactaagct