药用植物组培技术之三-无菌操作.pptVIP

实验三 无菌操作技术 一、实验目的： 通过在超净工作台上进行无菌操作验练，使学生初步掌握组织培养的无菌操作技术。 二、实验原理 灭菌是组织培养中重要的工作环节之一。 组织培养中要求无菌室、超净工作台达到无菌状态，植物材料也要经过消毒灭菌后再接种，接种人员的双手同样如此。 人为因素（工作人员本身）：工作服、帽、口罩、酒精擦手。 物品因素 器皿和用具 培养皿：洗→热压 玻璃器皿：洗→干热（干热箱）或晾干 接种用具：用CCl4布擦→湿布擦→ 泡75%~95%酒精→烧 培养基：湿热 培养材料 外部细菌：用水冲洗→化学药剂处理 内部细菌 茎尖培养 加抗生素：青霉素、利福平 操作的空气：洗刷地板95%酒精擦超净工作台 用化学试剂薰蒸 污染来源 无菌室和超净工作台可采用甲醛、高锰酸钾混合薰蒸，结合紫外灯照射20～30分钟； 外植体可采用75%酒精和0.1%的升汞杀菌； 双手可用75%的酒精棉球擦拭； 接种工具可采用75%酒精棉球擦拭，再经火焰灼烧灭菌。 三、操作步骤a、实验器具和材料的准备b、用75%的酒精擦拭超净工作台，然后室内及超净工作台用紫外灯杀菌20min-30min。c、关紫外灯、打开风机，过5-10min进入缓冲间，以75%酒精洗手和手臂，更换无菌服、帽子和口罩。进入接种室。（注：没有特别情况，尽量不要下工作台） d 用70－75％的酒精拭擦台面并消毒双手。试验用具也应该用酒精消毒。点燃酒精灯，将金属器械在其火焰上灼烧，冷却待用。 注意：所有操作应在火焰近处并经过灼烧进行。金属器械不能过度灼烧，以防退火。移液管不能灼烧，培养瓶口、塑料材料、橡胶材料过火焰不能时间太长。 E、取流水冲洗（至少30min）过的外植体，用一定的消毒剂浸泡消毒，用无菌水冲洗3~4次，放入无菌培养皿中，置于酒精灯火焰下方，用无菌的接种器械进行分离、切割或其他处理。 F、打开培养瓶，瓶口在灯焰处旋转灼烧，用镊子将培养材料置于培养基上，灼烧镊子放回，灼烧瓶口，盖上瓶塞。G、用酒精擦洗工作台和手。进行下一轮操作。 注意（1）进行培养时，动作要准确敏捷，但又不必太快，以防空气流动，增加污染机会。（2）不能用手触及已消毒器皿，如已接触，要用火焰烧灼消毒或取备品更换。 （3）为拿取方便，工作台面上的用品要有合理的布局，原则上应是右手使用的东西放置在右侧，左手用品在左侧，酒精灯置于中央。（4）工作由始至终要保持一定顺序性，组织或细胞在未做处理之前，勿过早暴露在空气中。同样，培养液在未用前，不要过早开瓶；用过之后如不再重复使用，应立即封闭瓶口直立可增加落菌机会。 （5）吸取营养液、细胞悬液及其它各种用液时，均应分别使用吸管，不能混用，以防扩大污染或导致细胞交叉污染。（6）工作中不能面向操作区讲话或咳嗽，以免唾沫把细菌或支原体带入工作台面发生污染。（7）手或相对较脏的物品不能经过开放的瓶口上方，瓶口最易污染，加液时如吸管尖碰到瓶口，则应将吸管丢掉。 接种时在近火焰处打开瓶口，使瓶倾斜，以免空气中微生物落入瓶中 正 确 错 误 整个接种操作应在近火焰处进行，且动作要迅速 正 确 错 误 接种过程中尽可能达到悬空要求 防止操作带来的污染 正 确 错 误 接种时不得用手接触瓶盖内壁或瓶口 正 确 错 误 瓶盖朝上放，接种完毕后立即盖好瓶口 正 确 错 误 接种完一瓶用火烧用具以防止交叉污染产生 种子和分生组织：培养时通常将其贴放在培养基表面，而不是插到培养基内部，以免供氧不足 正 确 错 误 接种茎段：注意形态学下端插入培养基内，而形态学上端露于空气中 正 确 错 误 四、作业 （一）将本次实验内容整理成实验报告。 （二）接种一周后，观察接种材料的污染情况，并分析污染原因。