[生物学]流式细胞仪.ppt

流式细胞术 一、流式细胞术（Flow Cytometer, FCM） 流式细胞术就是对于处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒进行多参数的、快速的定量分析和分选的技术。 二、流式细胞仪结构 (1) 流动室及液流驱动系统; (2) 激光光源及光束成形系统; (3) 光学系统; (4) 信号检测与存贮、显示、分析系统， (5) 细胞分选系统。 三、检测原理 悬浮状态的细胞 单个流动通过 检测区，在那里 产生散射光和荧光 被采集，过滤 然后 转换成数字信号 存储于电脑上。 （一）让细胞单个流动通过检测区 （二）检测信号 1。散射光信号 散射光不依赖任何细胞样品的制备技术(如染色)，因此被称为细胞的物理参数（或称固有参数）。 散射光分为前向角散射( FSC ，Forward Scatter ) 和侧向角散射(SSC，Side Scatter)， 侧向散射光对细胞膜、胞质、核膜的折射率更为敏感，可提供有关细胞内精细结构和颗粒性质的信息。 四、流式细胞术的特点 分析群体细胞 所需时间短 多参数分析 定性或定量 可检测； 细胞大小 细胞的核质比例 细胞表面分子 细胞质内分子 细胞核内分子 可判断： 细胞类型 细胞活性 细胞生理状态 细胞周期 细胞分化（癌变） 细胞凋亡 可分选细胞 可用于： (二) 实例一、利用流式细胞术分析细胞周期 细胞内的DNA含量随细胞周期进程发生周期性变化。 利用荧光染料PI标记的方法，通过流式细胞仪对细胞内DNA的相对含量进行测定，可分析细胞周期各时相的百分比。 (三) 实例二、Annexin V-FITC结合膜表PS实验检测细胞凋亡 将液流断裂成液滴 对含有目的细胞的液滴加上电荷 使用偏转电场将带电的含有目的细胞液滴偏转到对应的收集容器中 * 流式细胞仪(Flow Cytometer):是集光电子物理，光电测量，计算机，细胞荧光化学，单抗技术为一体的高科技细胞分析仪。 Injector Tip Purdue University Cytometry Laboratories Flow Cell Injector Tip Fluorescence signals Focused laser beam Sheath fluid Forward Angle Light Scatter FALS Sensor Laser 前向角散射：前向角散射与被测细胞的大小有关，确切说与细胞直径的平方密切相关。 通常在FCM应用中，选取FSC作阈值，来排除样品中的各种碎片及鞘液中的小颗粒，以避免对被测细胞的干扰。 90 Degree Light Scatter FALS Sensor 90LS Sensor Laser 侧向角散射：侧向角散射是指与激光束正交90度方向的散射光信号。 Laser 2。荧光信号 Fluorescence FALS Sensor Fluorescence detector (PMT3, PMT4 etc.) 不能 可直接利用细胞培养板进行上样 高通量筛查 定性 定性定量 结果表示 不能 能够实现高速分选 分选 可同时检测的参数有限 可实现六参数－十八个参数的同时分析 多参数分析 慢 高速分析，分析速度10000个细胞/秒 速度 荧光显微镜 流式细胞术 四、流式细胞术的应用 临床研究 淋巴细胞亚群测定、血小板分析、网织红细胞分析、白血病和淋巴瘤免疫分型、HLA-B27分析、PNH诊断、人类同种异体器官移植中应用、细胞因子测定、AIDS诊断与治疗和疗效评价、flow-FISH法测定端粒长度 基础研究 淋巴细胞功能、树突状细胞（DC）研究、造血干细胞研究、细胞周期分析、细胞凋亡分析、凋亡相关蛋白分析、细胞功能研究、多药耐药基因研究（MDR）、肿瘤相关基因表达研究、RNA测定、DNA测定、总蛋白测定、癌基因和抑癌基因表达产物测定、血管内皮细胞研究 样品 单细胞 悬液 标记 荧光抗体 检测 表型测定 细胞分选 （一）流式细胞术操作流程 统计学 分析 继续 培养 样品制备 1000rpm 5分钟收集2X106个细胞 PBS漂洗 两次 70%酒精 4度固定过夜 收集固定的细胞 PBS漂洗 0.5 PBS 悬浮细胞 2.5μl 10μg/μl RNase A 37度消化1小时 过300目细胞筛 50μl 0.1mg/ml PI（含1%Triton)， 1000rpm 5分钟 两次 混匀，室温 静止5分钟 上机 检测结果 还可初步判断细胞凋亡 *