[医学]生物制药学——第十章 离心技术.pptVIP

例如：直径1000mm，转速1000转/分的离心机： RCF= =(2×3.1415×1000)2×50/3600×980 =560 （g） 六、分子量计算 （2）按结构分类 ? 台式，落地式 ? 立式，卧式 ? 沉降式，过滤式 ? 转头式，管式，碟片式 ? 电动式，透平式 第二节 制备超离心 制备超离心：在强大的离心力作用下，利用不同密度、质量、大小、形状的组分粒子间沉降行为的差异，将其分离-纯化的方法。 应用于生物大分子、细胞器、病毒、细胞等。 特点：分离能力强、分辨率高、条件温和； 设备要求高，价格昂贵。 区带转子（又称Anderson）： 区带转头的构造是由旋转钵、带有四个翼的转头心和密封装置等部件组成。 离心时不用离心管。 Vmax = 60,000rpm。 没有“壁效应”。 适用于密度梯度离心。 垂直管转子 离心管中心线与转轴平行，是一种特殊类型的定角转子。 密度梯度：水平→垂直→水平 转换。 离心时，对流不显著，沉降时间短。 需有0→1000 r/min慢加速及1000→0 r/min慢减速及与正常程序之间的转换功能。 适用于差分、密度梯度及等密度离心。 塑料离心管 优点：透明（或半透明）；硬度小，可用穿刺法取出梯度。 缺点：易变形，抗有机溶剂腐蚀性差，寿命短。 不锈钢管：强度大，不变形，能抗热，抗冻，抗化学腐蚀（也应避免接触强腐蚀性化学药品，如强酸、强碱等）。 管盖有三种作用： ①防止样品外泄（放射性、毒性、强腐蚀性样品）。 ②防止样品挥发失衡。 ③支持管口以防变形。 用途： 本法适于分离颗粒大小不同而密度相近或相同的组分，如DNA与RNA混合物、核蛋白体亚单位及线粒体、溶酶体及过氧化物酶体等。 用途 常用于分离大小相似而密度差异较大的物质。 在分离基因（DNA片段）和RNA中获得良好效果。 2、密度梯度介质的基本要求 ?自身密度大，且溶解度足够大，以便制作出密度范围大的密度梯度。 ?理化性质稳定，生物惰性；离子强度低，渗透压小，黏度小。 ?具某种可测性（如折射率）以测其浓度（密度），但不干扰分离组分的测定。 ?便于除去或回收。此外还有纯度，价格等因素。 （5）直线型梯度的斜率 离心形成的梯度斜率与离心力成正比（ 和 ），与扩散力成反比。 五、离心制备的步骤 生物大分子： 组织→匀浆→过滤→分级离心→梯度区带离心 细胞： 组织细胞→分散（酶解） →梯度区带离心 六、制备超离心注意事项 注意平衡；查阅目的物信息 第三节 分析型超速离心法 分析性超速离心技术：用于观察物质颗粒在离心力场中运行行为的技术，常用于测定颗粒的沉降速度、沉降系数、扩散系数，计算分子量，估计生物大分子纯度、判断生物大分子形状、大小、缔合情况及构象变化等信息。 测定范围：1×102~1×106 分辨能力：0.005s以下。 与制备用机型的不同点： ?由于盛液器（离心池）有“光学窗口”，故受材料强度限制，允许转速略低，在80000 rpm以内使用。 ?转速与温度直接影响测定数据，必须控制很严：转速偏差±1.5‰，温差±0.1℃ ?附有动态光学检测，数据分析系统。 ?线形梯度（最常用） ?阶梯梯度：梯度容量大，分离快， 主要用于 颗粒区带很靠近时的等密度区带离心。 ?凹形梯度（对数型）：常用等密度区带离心时， 提高较低密度颗粒组分的分辨率。 ?凸形梯度（指数型）：常用等密度区带离心时， 提高较高密度颗粒组分的分辨率。 ?复合型梯度；包含上述一个以上的梯度形状， 一次离心即可彻底分离样品组分。 （3）梯度的形状 概念：指在达到分离要求前提下，梯度介质 容纳样品的最大数量。 与样品组成，分离要求有关； 与梯度总体积、斜率、介质粘度有关； 与转速、转子形式有关； 速度区带离心时，与样品体积、浓度有关；分离 要求高、梯度斜率大，则容量下降。 （4）梯度的容量 样品组分性质悬殊，可用大斜率，短离心管：区带窄，区带容量小，费时少。 样品组分性质相近，可用小斜率，长离心管：区带宽，区带容量大，费时多。 4、密度梯度的制备 (1) 不连续梯度的制备（阶梯梯度） 用手工由底部向上分层加入渐浓的介质溶液，由于扩散作用可自然形成连续梯度。 (2)