32_酶的提取与分离纯化280二教材教学课件.pptVIP

第三章 酶的提取与分离纯化 ★酶的提取基本概况 ★离心法酶的分离纯化; 2、沉淀分离（根据溶解度的不同）提取 特点:使溶液中的溶质由液相转变为固相析出 古老、实用、简单的初步分离方法 生物大分子制备中常用沉淀方法： 1 中性盐沉淀（盐析法） 2 有机溶剂沉淀 3 选择性沉淀（热变性和酸碱变性） 4 等电点沉淀 5 有机聚合物沉淀; 2.1 盐析沉淀法（改变离子强度） ①基本原理（盐溶和盐析）:向蛋白质或酶的水溶液中 加入中性盐，可产生两种现象： ●盐溶（salting in） ： 低浓度的中性盐增加蛋白质的溶解度。 ●盐析（salting out） ： 高浓度的中性盐降低蛋白质的溶解度。;蛋白质的盐析; 原因： 高盐浓度下盐离子与蛋白质分子争夺水分子，除去蛋白质的水合外壳，降低溶解度而沉淀。 不同蛋白质分子量、表面电荷不同，在不同盐浓度下沉淀，逐渐增大盐浓度，不同蛋白质先后析出，称分段盐析。;蛋白质分子表面的疏水区域和荷电区域 ;;★;②盐析用盐 ●常用（NH4）2 SO4，其突出优点： a. 溶解度大 b. 分离效果好 c. 不易引起变性 d. 价格便宜; ③ 盐浓度的表示 用饱和（溶解）度表示: 溶液中饱和硫酸铵的体积 饱和度＝ 溶液的总体积;盐析操作; ⑶盐析曲线的制作 如要分离一种新的蛋白质或酶，应先确定沉淀 该物质的硫酸铵饱和度。 蛋白质量(mg)或酶活力 ; 硫酸铵浓度（%） 枯草杆菌?-淀粉酶发酵液的盐析曲线 ;⑷盐析的影响因素 ●离子强度和种类（介绍盐析常数） 蛋白质溶解度与盐浓度之间的关系： ; 当温度一定时，S0对于某一溶质是常数，用β表示，盐析方程式可改写为： log S = β- Ks I 两种盐析法： Ks分级盐析法 ：在一定的pH和温度条件下，利用不同蛋白质Ks的不同，通过改变离子强度或盐浓度（即改变I值）的沉淀方法。 β分级盐析法 ：在一定离子强度下，通过改变溶液的pH及温度的沉淀方法。;●蛋白质浓度： 稀回收沉淀难，浓易共沉淀，2.5%-3%最好。 ●pH值：等电点处最易沉淀。 ●温度的影响： 稀盐溶液中，温度升高蛋白质溶解度提高。 浓盐溶液中，温度升高蛋白质溶解度下降。 一般可在室温下进行。某些对温度敏感的酶，可在0℃～4℃下操作。; 2.2 有机溶剂沉淀（降低介电常数） 利用酶等蛋白质在有机溶剂中的溶解度不同而使之分离的方法。 ① 沉淀机理 降低溶液的介电常数 部分地引起蛋白质脱水 ②常用有机溶剂 丙酮?乙醇?甲醇，用量一般为酶液体积的2倍左右，终浓度为70%。 ; ③ 优缺点： 优点：分辨率比盐析法高 沉淀不需脱盐 溶剂易蒸发，沉淀易离心 缺点：容易引起蛋白质变性失活 有机溶剂易燃、易爆，对安全要求较高。 ; ④ 影响有机溶剂沉淀的因素 温度 ：低温（0℃）操作。 pH 值：尽可能靠近其等电点。 离子强度：采用0.05mol/L的稀盐溶液, 增加蛋白质在有机溶剂中的 溶解度,目的防止蛋白质变性 蛋白质浓度：适当，一般为5?20mg/ml ; 2.3 等电点沉淀(isoelectric precipitation) ① 原理 蛋白质在等电点时溶解度最低 不同的蛋白质具有不同的等电点 ② 使用方法 单独使用较少（用于从粗酶液中除去某些等电点相距较大的杂蛋白），多与其它方法联合使用（如盐析法、有机溶剂法），因蛋白质在等电点时仍有一定的溶解度。 ; ③优点： 大多数蛋白质的pI都在偏酸性范围内; 无机酸（如磷酸、盐酸、硫酸）价格较低; 无需