(保健食品课件）三、增强免疫力功能评价的基本原理与方法.ppt

增强免疫力功能结果判定 增强免疫力功能判定：在细胞免疫功能、体液免疫功能、单核—巨噬细胞功能、NK细胞活性四个方面任两个方面结果阳性，可判定该受试样品增强免疫力功能。 细胞免疫功能结果判定：细胞免疫功能测定项目中的两个实验结果均为阳性，或任一个实验的两个剂量组结果阳性，可判定细胞免疫功能测定结果阳性。 体液免疫功能结果判定：体液免疫功能测定项目中的两个实验结果均为阳性，或任一个实验的两个剂量组结果阳性，可判定体液免疫功能测定结果阳性。 单核—巨噬细胞功能结果判定：单核—巨噬细胞功能测定项目中的两个实验结果均为阳性，或任一个实验的两个剂量组结果阳性，可判定单核—巨噬细胞功能结果阳性。 NK细胞活性结果判定：NK细胞活性测定实验的两个剂量组结果阳性，可判定NK细胞活性结果阳性。 Thank You！ 抗体生成细胞检测（Jerne改良玻片法） 免疫动物? 取羊血，用生理盐水洗涤3次，每次离心（2000r/min）10min，计数细胞，每只鼠经腹腔或静脉注射SRBC? 5×107～2×108个。也可将压积SRBC 用生理盐水配成2%（v/v）的细胞悬液，每只鼠腹腔注射0.2mL 脾细胞悬液制备??? 将SRBC免疫4～5天后的小鼠颈椎脱臼处死，取出脾脏，放在盛有Hanks液的小平皿内，轻轻撕碎脾脏，制成细胞悬液，经200目筛网过滤，或用4层纱布将脾磨碎，离心（1000/min）10min，用Hanks液洗2遍，最后将细胞悬浮在5mL RPMI1640培养液中，计数细胞，并将细胞浓度调整为5x106个/mL。也可将细胞悬浮在8mLHanks液，测定脾空斑形成数。 抗体生成细胞检测（Jerne改良玻片法） 空斑的测定??? 将表层培养基（1g琼脂糖加双蒸水至100mL）加热溶解后，放45℃水浴保温，与等量pH7.2～7.4、2倍浓度的Hanks液混合，分装小试管，每管0.5mL，再向管内加50μL 10% SRBC(v/v，用SA液配制)，20μL脾细胞悬液（5×106个/mL）或25μL脾细胞悬液，迅速混匀，倾倒于已刷琼脂糖薄层的玻片上，做平行片，待琼脂凝固后，将玻片水平扣放在片架上，放入二氧化碳培养箱中温育1～1.5h，然后用SA缓冲液稀释的补体（1：8）加入到玻片架凹槽内，继续温育1～1.5h后，计数溶血空斑数。 抗体生成细胞检测（Jerne改良玻片法） 数据处理及结果判定 用空斑数/106脾细胞或空斑数/全脾细胞来表示，受试样品组的空斑数显著高于对照组的空斑数，可判定该项实验结果阳性。 血清溶血素的测定 －血凝法 原理??? 用SRBC免疫动物后，产生抗SRBC抗体（溶血素），利用其凝集SRBC的程度来检测溶血素的水平。 仪器和材料??? SRBC、生理盐水、微量血凝实验板、离心机 血清溶血素的测定 －血凝法 实验步骤 SRBC? 绵羊颈静脉取血，将羊血放入有玻璃珠的灭菌锥形瓶中，朝一个方向摇动，以脱纤维，放入4℃冰箱保存备用，可保存2周。 免疫动物及血清分离? 取羊血，用生理盐水洗涤3次，每次离心(2000r/min)10min。将压积SRBC用生理盐水配成2％（v/v）的细胞悬液，每只鼠腹腔注射0.2mL进行免疫。4～5天后，摘除眼球取血于离心管内，放置约1h，将凝固血与管壁剥离，使血清充分析出，2000r/min离心10min，收集血清。 凝集反应? 用生理盐水将血清倍比稀释，将不同稀释度的血清分别置于微量血凝实验板内，每孔100μL ，再加入100μL 0.5％(v/v)的SRBC悬液，混匀，装入湿润的平盘内加盖，于37℃温箱孵育3h，观察血球凝集程度。 血清溶血素的测定 －血凝法 数据处理及结果判定血清凝集程度一般分为5级（0－Ⅳ）记录，按下式计算抗体积数，受试样品组的抗体积数显著高于对照组的抗体水平，可判定该项实验结果阳性。抗体水平＝（S1+2S2+3S3……nSn）式中1、2、3……n代表对倍稀释的指数，S代表凝集程度的级别，抗体积数越大，表示血清抗体越高。0级? 红细胞全部下沉，集中在孔底部形成致密的圆点状，四周液体清皙。Ⅰ级? 红细胞大部分沉集在孔底成园点状，四周有少量凝集的红细胞。Ⅱ级? 凝集的红细胞在孔底形成薄层，中心可以明显见到一个疏松的红点。Ⅲ级? 凝集的红细胞均匀地铺散在孔底成一薄层,中心隐约可见一个小红点。Ⅳ级? 凝集的红细胞均匀地铺散在孔底成一薄层，凝块有时成卷折状。 血清溶血素的测定 －血凝法 注意事项??? 血清稀释时要充分混匀。最后一个稀释度应不出现凝集现象。 血清溶血素的测定 －半数溶血值（HC50）的测定 原理??? 用SRBC免疫动物后，产生抗SRBC抗体（溶血素），与SRBC一起孵育，在补体参与下，可发生溶血反应，释放血红蛋白，通过测