分子生物学研究策略-基因表达技术（10月25日）.ppt

分子生物学研究策略 Research Strategy on Molecular Biology 3、基因分子生物学的基本技术 3.1 基因的分子杂交技术 3.2 基因的扩增技术（PCR） 3.3 基因的突变技术（转座技术） 3.4 基因的表达技术 （表达系统） 3.5 转基因技术 （转基因动物、 转基因植物） 3.6 微阵列分析 **基因表达系统 1、大肠杆菌表达系统 2、芽孢杆菌表达系统 3、乳酸菌基因表达系统 4、链霉菌基因表达系统 5、酵母菌表达系统 6、丝状真菌表达系统 7、昆虫表达系统 8、哺乳动物细胞表达系统 9、植物生物反应器 1、大肠杆菌表达系统（Gene Expression system in E.coli） 1）大肠杆菌表达系统 的特点： （1）遗传背景清楚 （2）目的基因表达水 平高 （3）培养周期短 （4）抗感染能力强 2）大肠杆菌表达系统研究的发展趋势 完善现有的表达系统； 重组蛋白质的正确折叠； 构象形成； 蛋白质的分泌； 菌体表面表达技术及其应用； 重组蛋白质修饰加工。 真核基因在不同表达系统的表达 表达白细胞介素IL-3(成熟蛋白) 大肠杆菌表达系统 20-30u 地衣芽孢杆菌表达系统 250-300u 酵母菌表达系统 20u 哺如动物细胞 2u 2、芽胞杆菌表达系统（Gene Expression system in Bacillus） 1）特点 枯草芽孢杆菌是非致病的土壤微生物，严格生长在有氧条件下。 枯草芽孢杆菌遗传学相当先进，很多噬菌体和质粒适合用作克隆载体。 芽孢杆菌可大量产生几种商品酶，如?-淀粉酶，蛋白酶及苏云金杆菌的杀虫晶体蛋白等，发酵技术发达。 具有单层细胞膜组成较简单的细胞外壳。 易于分离纯化分泌蛋白 2）枯草杆菌宿主菌株 由于大肠杆菌的CaCl2转化法对枯草芽孢杆菌无效 （1）选择可转化的菌株 *168菌株及突变体： 营养要求、芽孢形成和萌发、蛋白酶缺失、重组缺陷、限制/修饰系统缺陷、转座子插入 （2）选择转化的方法 感受态转化： 原生质体转化： 电转化：甘氨酸添加培养感受态 其它方法，如转导、结合转移 3）、可作为宿主的其它菌种： 嗜碱芽孢杆菌Bacillus abcalophilus 蛋白酶 淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefacilus ?-淀粉酶 短芽孢杆菌Bacillus brevis 地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis 淀粉酶，抗真菌肽 巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium 淀粉酶 短小芽孢杆菌Bacillus pumilus 蛋白酶 球形芽孢杆菌Bacillus sphaericus 灭蚊毒素蛋白 嗜热芽孢杆菌Bacillus stearothermophilus 高温?-淀粉酶 苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis 杀虫晶体蛋白 耐碱的芽孢杆菌Bacillus alcalophilic 碱性蛋白酶 炭疽芽孢杆菌 Bacillus anthracis 4）枯草芽胞杆菌表达系统研究的发展趋势 1、表达真核基因 蛋白酶水解——缺陷型、抑制剂 2、表达商业用酶 克隆基因的整合 3、表达杀虫晶体蛋白 提高杀虫毒力，减少杀虫时间，增加广谱 4、利用芽孢杆菌基因工程技术扩大和加 强在医药领域多个方面的应用 3、乳酸菌基因表达系统（Gene Expression system in Lactic Acid Bacteria） 1）特点： 乳酸菌指发酵糖类主要产物为乳酸的一类无芽孢、革兰氏染色阳性细菌的总称。 大多数不运动，少数以周毛运动。 菌体常排列成链。 在其发酵产物中只有乳酸的称为同型乳酸发酵，而产物中除乳酸外还有较多乙酸、乙醇、CO２等物质的称为异型乳酸发酵。 有微好氧菌和专性厌氧菌。 Lactic Acid Bacteria Genera: Streptococcus Leuconostoc Pediococcus Lactobacillus Enterococcus Lactococcus 2）理想乳酸菌表达载体的特征： 1、稳定的遗传、传代能力（复制子） 2、具有显性的转化筛选标记（Em