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分子生物学研究策略 Research Strategy on Molecular Biology 3、基因分子生物学的基本技术 3.1 基因的分子杂交技术 3.2 基因的扩增技术(PCR) 3.3 基因的突变技术(转座技术) 3.4 基因的表达技术 (表达系统) 3.5 转基因技术 (转基因动物、 转基因植物) 3.6 微阵列分析 **基因表达系统 1、大肠杆菌表达系统 2、芽孢杆菌表达系统 3、乳酸菌基因表达系统 4、链霉菌基因表达系统 5、酵母菌表达系统 6、丝状真菌表达系统 7、昆虫表达系统 8、哺乳动物细胞表达系统 9、植物生物反应器 1、大肠杆菌表达系统(Gene Expression system in E.coli) 1)大肠杆菌表达系统 的特点: (1)遗传背景清楚 (2)目的基因表达水 平高 (3)培养周期短 (4)抗感染能力强 2)大肠杆菌表达系统研究的发展趋势 完善现有的表达系统; 重组蛋白质的正确折叠; 构象形成; 蛋白质的分泌; 菌体表面表达技术及其应用; 重组蛋白质修饰加工。 真核基因在不同表达系统的表达 表达白细胞介素IL-3(成熟蛋白) 大肠杆菌表达系统 20-30u 地衣芽孢杆菌表达系统 250-300u 酵母菌表达系统 20u 哺如动物细胞 2u 2、芽胞杆菌表达系统(Gene Expression system in Bacillus) 1)特点 枯草芽孢杆菌是非致病的土壤微生物,严格生长在有氧条件下。 枯草芽孢杆菌遗传学相当先进,很多噬菌体和质粒适合用作克隆载体。 芽孢杆菌可大量产生几种商品酶,如?-淀粉酶,蛋白酶及苏云金杆菌的杀虫晶体蛋白等,发酵技术发达。 具有单层细胞膜组成较简单的细胞外壳。 易于分离纯化分泌蛋白 2)枯草杆菌宿主菌株 由于大肠杆菌的CaCl2转化法对枯草芽孢杆菌无效 (1)选择可转化的菌株 *168菌株及突变体: 营养要求、芽孢形成和萌发、蛋白酶缺失、重组缺陷、限制/修饰系统缺陷、转座子插入 (2)选择转化的方法 感受态转化: 原生质体转化: 电转化:甘氨酸添加培养感受态 其它方法,如转导、结合转移 3)、可作为宿主的其它菌种: 嗜碱芽孢杆菌Bacillus abcalophilus 蛋白酶 淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefacilus ?-淀粉酶 短芽孢杆菌Bacillus brevis 地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis 淀粉酶,抗真菌肽 巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium 淀粉酶 短小芽孢杆菌Bacillus pumilus 蛋白酶 球形芽孢杆菌Bacillus sphaericus 灭蚊毒素蛋白 嗜热芽孢杆菌Bacillus stearothermophilus 高温?-淀粉酶 苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis 杀虫晶体蛋白 耐碱的芽孢杆菌Bacillus alcalophilic 碱性蛋白酶 炭疽芽孢杆菌 Bacillus anthracis 4)枯草芽胞杆菌表达系统研究的发展趋势 1、表达真核基因 蛋白酶水解——缺陷型、抑制剂 2、表达商业用酶 克隆基因的整合 3、表达杀虫晶体蛋白 提高杀虫毒力,减少杀虫时间,增加广谱 4、利用芽孢杆菌基因工程技术扩大和加 强在医药领域多个方面的应用 3、乳酸菌基因表达系统(Gene Expression system in Lactic Acid Bacteria) 1)特点: 乳酸菌指发酵糖类主要产物为乳酸的一类无芽孢、革兰氏染色阳性细菌的总称。 大多数不运动,少数以周毛运动。 菌体常排列成链。 在其发酵产物中只有乳酸的称为同型乳酸发酵,而产物中除乳酸外还有较多乙酸、乙醇、CO2等物质的称为异型乳酸发酵。 有微好氧菌和专性厌氧菌。 Lactic Acid Bacteria Genera: Streptococcus Leuconostoc Pediococcus Lactobacillus Enterococcus Lactococcus 2)理想乳酸菌表达载体的特征: 1、稳定的遗传、传代能力(复制子) 2、具有显性的转化筛选标记(Em
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