原位光谱法检测白腐真菌P450的诱导及其降解功能.pdfVIP

V01．28 高等学校化学学报 No．8 2 007年8月 CHEMICALJOURNALOFCHINESEUNIVERSlTIES 1469～1474 原位光谱法检测白腐真菌P450的 诱导及其降解功能 宁大亮，王慧，庄芫，李冬 (清华大学环境科学与工程系，环境模拟与污染控制国家重点联合实验室，北京100084) 摘要利用诱导一原位光谱分析法，对黄孢原毛平革菌中的微粒体P450在蛋白质水平上进行原位直接检测 和表征．研究结果表明，正已烷、苯甲酸、萘和五氯酚对黄孢原毛平革菌P450酶系均有不同程度的诱导作 用，在合适的诱导剂量和诱导条件下，对黄孢原毛平革菌P450的诱导量分别达到未诱导时的75，5．6，3．1 和3．5倍其中五氯酚对真菌P450酶系的诱导现象尚未见报道在不同的培养条件下测定了苯甲酸与P450 的底物结合光谱．并检测出微粒体酶液中依赖NADPH的苯甲酸降解活性，证实了降解苯甲酸的P450基因 在黄孢原毛平革菌中能够顺利合成并表现出明显的催化活性，抑制剂实验结果表明，除了P450的催化降解 途径以外，白腐真菌中还存在其它的苯甲酸降解途径． 关键词CO结合差光谱；白腐真菌；P450；诱导；降解功能 中图分类号0657；X13文献标识码A 文章编号0251-0790f2007)08—14694)6 黄孢原毛平革菌(Phanerochaete 的木质素，而且对苯并芘、多氯联苯、二嘿英、五氯酚、DDT、氯丹、毒杀芬和三硝基甲苯等许多难降 解的有机污染物都有明显的降解功能…．白腐真菌降解各类难降解有机物的机理一直是环境领域研究 的热点问题．在大量研究揭示白腐真菌木质素降解酶等胞外酶在降解中的重要作用的同时，也有越来 利表达o“．这样丰富的P450酶系与黄孢原毛平革菌具有降解众多污染物的功能之间可能存在非常密 切的关系．P450在高等生物体内对各类有毒物质的反馈机理和解毒功能已经不止在医用毒理学和药 学，而且在环境污染生物修复领域成为研究热点”。…．由于白腐真菌在污染控制与治理中具有非常好 的应用前景，其P450酶系与环境污染物的关系也日益受到关注．研究发现，十六烷、萘、壬基酚、多 能与这些物质的降解密切相关；最近，通过基因异源表达又发现了黄孢原毛平革菌具有苯甲酸羟化滔 P450相对含量很少、在胞外极易失活和分离及检测困难等问题，大多数研究工作者仅获得了间接的证 据，直接分离胞内P450酶液的研究仅仅在苯并(a)芘羟化酶上有所突破”…，此后鲜有报道．因此，建 立合适的检测方法，在酶学水平上全面、深入地揭示P450降解功能及其作用机理已成为黄孢原毛平 革菌酶系研究的关键问题，对充分开发白腐真菌的强大功能具有重要意义． 本文利用诱导一原位光谱分析法(此处“原位”是指不采用异源表达而是直接检测原菌株的微粒体 收稿日期：2006-10-25 基金项目：国家“九七三”计划(批准号：2004CB418506)和国家自然科学基金(批准号资助 联系人简介：王慧(1969年出生)，女，博￡，副教授，主要从事环境生物技术和污染土壤修复原理与技术的研究． E-mail：Wallg}lui@tsingllua．edu，cn 1470 高等学校化学学报 VoI．28 烷、苯甲酸、萘和五氯酚等不同类型的污染物对黄抱原毛平革菌P450的诱导作用，并通过底物结合差 谱实验和抑制剂实验证明，P450在苯甲酸降解中的作用， 1实验部分 1．1试剂与仪器 白腐真菌采用黄孢原毛平革菌BKM—F一1767(ATCC Sigma公司)；正已烷、苯甲酸、萘、五氯酚、丙酮、二甲亚砜、甲醇及乙酸铵均为国产分析纯．土豆琼 脂固体培养基(每升培养基含200～300g土夏的浸出液、20g葡萄糖及20g琼脂粉)；土豆液体培养 基(简称PDB，每升培养基含200—300 g土豆的浸出液、20g葡萄糖及0．02mol／I．pH为5．0的醋酸缓 冲溶液)；低氮培养基(参考Tien等。”1提出的配方，1．2