人教版高中生物选修一5.2多聚酶链式反应扩增DNA片段课件5共28张PPT.ppt

多聚酶链式反应(PCR技术)， 是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，故又称为DNA体外扩增技术。 ★分子生物学研究中最强大的实验技术之一 ★其本质是在体外模拟胞内DNA分子复制的过程 美国科学家　穆利斯(K.B.Mullis) 发明了PCR技术　1993年诺贝尔奖 ㈠.DNA分子的结构 C、H、O、N、P 1.元素组成： 脱氧核苷酸 2.基本单位: 一.基础知识 脱氧核苷酸 磷酸 脱氧核糖 含氮碱基 嘌呤 嘧啶 腺嘌呤（A） 鸟嘌呤（G） 胞嘧啶（C） 胸腺嘧啶（T） 一个核苷酸上的磷酸基团上的“－OH”和另一个核苷酸分子的第3位碳原子上的羟基之间失去一分子水，形成磷酸二酯键. 3.多脱氧核苷酸链得形成 多脱氧核苷酸链结构简图 DNA分子的平面结构 A T G C A G C T 氢键 5端 3端 5端 3端 识别 ： DNA分子的3′ 端与5′ 端 -OH端为3′ ; 磷酸基团的末端为5′。 参与的组分 在DNA复制中的作用 解旋酶 DNA母链 4种脱氧核苷酸 DNA聚合酶 引物 总结：胞内DNA复制的基本体系 打开DNA双链 提供DNA复制的模板 合成子链的原料 催化合成DNA子链 使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸 ㈢.PCR(多聚酶链式反应） 2.DNA聚合酶特性 不能从头合成DNA，只能从DNA的3′端开始延伸DNA链，因此，DNA复制需要引物。 3.DNA聚合酶作用过程 当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后， DNA聚合酶就能从引物的3′端开始延伸DNA链，DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸。 1.定义： 是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。能以极少量的DNA为模板，在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝。 4.PCR原理 ⑴.在80－100°C的温度范围内，DNA的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为变性。 ⑵.当温度缓慢降低后，两条彼此分离的DNA链又会重新结合成双链。 ⑶.PCR利用了DNA的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合，现在使用的PCR仪实质上也是一台能够自动调控温度的仪器。 高温解决了打开双链的问题，但是，又导致DNA聚合酶失活的问题，耐高温的Taq DNA聚合酶解决了高温导致DNA聚合酶失活的问题，促成了PCR技术的自动化。 5.Taq DNA聚合酶的应用 6.需要为PCR反应提供的物质 缓冲液、DNA模板，分别与两条模板链相结合的两种引物，四种脱氧核苷酸，耐热的DNA聚合酶，同时通过控制温度使DNA复制在体外反复进行。 （1）变性：当温度上升到90 ℃以上时，双链DNA解聚为单链。 （2）复性：温度下降到50 ℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。 （3）延伸：温度上升到72℃左右，溶液中的四种脱氧核苷酸(A，T，C，G)在DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。 二、PCR的反应过程 PCR一般经历三十多次循环，每次循环可以分为三个基本步骤──变性、复性和延伸. （1）PCR循环--变性 95℃变性 （1）PCR循环--变性 95℃变性 （1）PCR循环--变性 95℃变性 （2）PCR循环—复性 55℃复性 （3）PCR循环—延伸 （3）PCR循环—延伸 （3）PCR循环—延伸 （3）PCR循环—延伸 5? 引物1 5? 引物2 第二次复制 第一次复制 5? 5? 5? 5? 5? 5? 模板DNA 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 25～30 次循环（复制）后，模板DNA的含量可以扩大100万（220）倍以上。 体内DNA复制与PCR的技术区别： 体内复制 PCR技术 解旋 在解旋酶作用下，细胞提供ATP，部分解开 加热到94oC,双链全部解开，不需解旋酶 引物 一小段RNA 一般用DNA片段 DNA聚合酶 细胞自身的DNA聚合酶（不耐高温） TaqDNA聚合酶 复制特点 半保留复制，边解旋边复制，多起点复制。 半保留复制，完全解旋后复制，从模板链的一端开始复制。 复制的方向 子链的5’端向 3’端延伸 子链的5’端向 3’端延伸 1、PCR仪 ㈠.设备及用具 实质上一台能够自动调控温度的仪器。 二.PCR的实验操作 2、微量离心管 一种薄壁塑料管，总容积为0.5ml 3、微量移液器 用于定量转移PCR配方中的液体，其上的一次性吸液枪头用一次更换一次。 （1）按配方将所需试剂摆放在实验桌上（准备） （2）用微量移液器按配方在微量离心管中依次加入各组分（移液） （3）盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁（混合） （4）将微量离心管放在离心机上（离心） （5）将离心管放入PCR仪上，设置好PCR仪的循环程序（反应） ㈡.实验操作步骤 PCR一般经历三十