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18个灵芝菌种的酯酶同工酶分析 №.6 Vo1.24 陕西科技大学 JOURNALOFSHAANXIUNIVERSITYOFSCIENCE8LTECHNOIOGY Dec.2006 ?65? 文章编号:1000--5811(2006)06--0065--05 18个灵芝菌种的酯酶同工酶分析 秦俊哲,姚艳芳,孙伟 (陕西科技大学生命科学与工程学院,陕西成阳712081) 摘要:对l8个灵芝菌株进行了茼丝培养观察,拮抗试验和酯酶同工酶聚丙烯酰胺凝胶电泳 实验,并对它们作了聚类统计分析.分析结果表明:在相似水平为5O时供试茼株聚合为6 类:第1类包括以韩芝为代表的7个茵株;第2类包括以赤芝为代表的5个茼株第3类包括 紫芝和黑芝;第4类为血芝和京大灵芝;第5类为白芝;第6类为日本赤芝.聚类分析结果与 形态特征及拮抗试验结果基本一致.实验还说明酯酶同工酶可作为灵芝良种选育的一种有效 标记方法,在茵种鉴定,保藏和管理方面具有重要作用. 关键词:灵芝;拮抗试验;酯酶同工酶;聚类分析 中图分类号:$646.2;Q556.1文献标识码:A 0引言 灵芝(Ganoderma)属于担子菌亚门,层菌纲,无隔担子菌亚纲,多孔菌目,灵芝菌科,灵芝属,具有很高 的药用价值和开发潜力,这些年来人工栽培的数量迅速增加,新的品种也不断被报道.但是,目前在灵芝 菌的栽培生产中普遍存在着菌种老化,品种退化,品种混杂,菌种选育滞后以及缺乏良好的菌种登记管理 制度等多方面的问题,而且即使选育出新菌株,也存在遗传性状不稳定和难以推广应用等亟待解决的难 题_】],这些问题给从事灵芝栽培及加工的企业造成了一定的经济损失,导致目前市场上的灵芝产品质量良 莠不齐,这已成为我国灵芝开发和相关产业发展中的严重障碍.因此,本论文选用我国目前普遍使用的灵 芝生产菌种为材料,研究现代生物技术在灵芝分类中的应用,通过对其生长特性和酯酶同工酶的分析,旨 在为灵芝菌的良种选育,种性鉴定及菌种管理等工作提供科学依据. 1材料与方法 1.1材料- l_l_1供试灵芝菌种 1(赤芝),2(信州灵芝),3(赤芝12号),4(韩芝),5(赤芝1o),6(日本红芝),7(京大灵芝),8(黑芝),9 (Ft本平芝R1),10(韩国灵芝H1),11(仙芝),12(甜芝),13(园芝),14(日本赤芝C1),15(紫芝),16(大仙 823),17(白芝),18(血芝).以上菌种除信州灵芝,京大灵芝,日本平芝,韩国灵芝,日本赤芝购自中国农业 大学外,其余菌种都由陕西科技大学生命科学与工程学院微生物菌种室提供. 1.1_2培养基 菌丝生长琼脂培养基:马铃薯200g,蔗糖2Og,酵母膏4g,KHzPO2g,MgSO4?7HzO0.5g,VBl 10.15mg,琼脂20g,水1000mI,pH自然;棉籽壳培养基:棉籽壳809/5,麸皮18,石膏1,砂糖19/5, 收稿日期t2006—10—10 作者简介;秦俊哲(1957).男.陕西省泾阳县人,高级工程师,研究方向:食药用真菌资源的研究与开发 .66.+陕西科技大学第24卷 !!!!!!!!!!!!!!!!!IIIII.———————I——————————II—IIII—————————————-—!I KHPO0.29/6,料水质量比1:(1.4～1.5),用13cm×30cm聚丙烯塑料袋分装,pH自然;药渣培养基: 药渣80%,麸皮17,石膏粉3.5,蔗糖19,6,KHPO,0.3%,MgS04?7Hz00.2,料水质量比11.5. 1.2实验方法 1.2.1菌丝体观察 按照无菌操作的要求,采用插片培养的方法在琼脂培养基上培养灵 菌丝体,当插片上附着有一层薄薄的菌丝体时取出,用棉蓝染色后进行 微观察.主要观察菌丝的形态外观,分支情况以及是否具有锁状联合 象. 2.2菌丝拮抗试验 按照无菌操作的要求,将18个灵芝供试菌株点接于琼脂平板培养基 ,每个平板均匀接入3种菌株,28℃培养7～10d,观察任意两种灵芝菌 种之间是否有拮抗现象发生. 图1部分茵丝照片(40O倍)1 .2.3酯酶同工酶(EsT—PAGE)分析 (1)菌丝培养:即平板培养法,将18个供试菌株分别接于琼脂平板培养基中28C培养,待菌丝刚刚长 满,每个菌株刮取一皿菌丝备用.(2)电泳:取上述获得的菌丝1g,分别加入1mLTBE缓冲液(O.5mol? I,pH6.5)和0.5g石英砂,冰浴研磨成匀浆,然后进行冷冻离心(8000r?rain一,30min,4℃),上清液 中以1:1加入4o蔗糖溶液和l滴溴酚蓝指示剂,即得样品液_2].实验采用垂直板聚丙烯酰胺凝胶电 泳(PAGE),浓缩胶浓度3,pH6.7,分离胶浓度8,pH8.8.电泳条件为:点样量2oL,8oV电泳1 h,150V电泳4h.酯酶染色采用a,