第六章 蛋白质工程——自制(修改)方法技巧.pptVIP

D、蛋白质组研究的一般过程： 细胞或组织样品 → 样品制备 → 二维凝胶电泳（2D－PAGE）分离蛋白质 → 计算机辅助分析2D－PAGE图象 → 对感兴趣的蛋白质进行酶解 → 质谱分析 → 数据库检索 → 蛋白质鉴定→分析蛋白质在细胞与组织中的表达情况。 整个过程大体上可分为分离、鉴定、分析三步。其中，蛋白质的分离和鉴定是蛋白质组研究技术方面的核心内容，与此相对应的两大核心技术即双向电泳凝胶和质谱技术。??? （一）蛋白质组分离技术 1、双向电泳 双向凝胶电泳是目前蛋白质组最有效的分离方法，又称二维电泳,由O’Farrell和Klose等人于1975年建立并成功地分离约1000个E. coli蛋白。 原理是在相互垂直的两个方向上，分别基于蛋白质不同的等电点和分子量，运用等电聚焦（IEF）和十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS），把复杂的蛋白质混合物中的蛋白在二维平面上分离展开。 第一相：等电聚焦 根据蛋白质分子的等电点不同进行分离（蛋白质沿pH梯度分离, 至各自的等电点）。 第二相： SDS将等电聚焦后的胶条放在SDS上电泳，使蛋白质分子在垂直的方向上按分子量不同进行分离。 2、凝胶染色 常采用银染和考马斯亮兰染色即可观察到具有许多蛋白质斑点的凝胶图像。也可进行荧光染色等。 大肠杆菌中的蛋白质组图谱 二维电泳荧光染色 二维电泳荧光检测 由于具有高分辨率的特点，双向凝胶电泳在蛋白质组学的研究当中始终占据着重要的地位。 该技术主要用于分离细胞或组织蛋白质粗提物，构建特定组织或细胞的蛋白质“二维参考图谱”，分析特定时间与生理状态下蛋白质的表达情况，进行蛋白质组差异比较。? （二）蛋白质的鉴定与分析： 　　 蛋白质在凝胶上被分离后，对于感兴趣的蛋白质点，可经切割、胰蛋白酶水解等处理，形成小的肽片段进行鉴定。常用的鉴定方法有蛋白质序列测定、氨基酸组成分析法及质谱等。其中，质谱鉴定由于具有高效、灵敏、准确、自动化、可同时分析多蛋白混合物等特点，已成为蛋白质组鉴定的核心技术。其基本原理是样品分子离子化后，根据不同离子之间的荷质比（M/E）的差异来分离并确定分子量。 肽段质谱鉴定后，从互联网二维电泳蛋白谱数据库中获取其详细信息，与库中已知蛋白质肽质谱比较，确定蛋白质是否已知或是何种蛋白，进一步进行功能分析。 f、蛋白质结构层次总结 蛋白质结构极其复杂，但具有明显的结构层次 一级结构（多肽链上的氨基酸排列顺序） 二级结构（多肽链主链骨架的局部空间结构） 超二级结构（二级结构单位的集合体） 结构域（多肽链上可以明显区分的球状区域） 三级结构（多肽链上所有原子和基团的空间排布） 四级结构（由球状亚基或分子缔合而成的集合体） 蛋白质各级结构之间的关系 四、蛋白质分子之间的相互作用 1、蛋白质四级结构聚合的亚基可被解离，但在适当的条件 下，游离的亚基又能重新聚合成具有四级结构的蛋白质 分子，如： 棕色固氮菌固氮酶钼铁蛋白分子的α2β2 四聚体。在较 低的蛋白质浓度或较低的pH、离子强度下，解离成α 和 β亚基，但在较高的蛋白浓度或较高的pH、离子强度 下， 又重组成四聚体。 2、在特殊环境条件下，具有四级结构的不同蛋白质分子的 亚基间可相互聚合，产生有活性的杂交分子，如: 棕色固氮菌固氮酶的铁(硫)蛋白分子可与红螺藻固氮菌 固氮钼铁蛋白分子产生聚合形成杂交的固氮酶复合物。 3、多肽和蛋白质各自分子间都能聚合成聚合物。 蛋白质的结构与功能密切相关，既与一级结构有关， 又与空间结构有关。 五、蛋白结构与功能的关系 1、一级结构与功能的关系 1）一级结构是空间构象的物质基础 ① 氨基酸组成变化可以改变蛋白质的功能 两种激素的组成相 似仅有两个氨基酸的 差别，但承担完全不 同的生理学功能。 ③ 分子病（一级结构改变引起） 基因突变导致蛋白质一级结构的突变，导致蛋白质生物 功能的下降或丧失，就会产生疾病，此病称为分子病。 如：镰刀状红细胞贫血症 ② 种属有差异，但相似的结构具有相似的功能 猪、牛和人等胰岛素功能、构成及分子量几乎一 样，氨基酸序列存在着个别的差异（仅有2-3 个氨基酸不同）。 最早从分子水平证明的 先天性遗传病 —— 镰刀形红细胞贫血症 镰刀形红细胞 正常血细胞 GAA（Glu） → GTA