总RNA的提取和RT-PCRPPT课件.pptVIP

实 验 总RNA的提取与RT-PCR; 完整RNA的提取和纯化,是进行RNA 方面的研究工作如Nothern杂交、mRNA分离、RT-PCR、定量PCR、cDNA合成及体外翻译等的前提。 掌握从细胞中提取总RNA的方法 掌握RT-PCR基因扩增的原理和操作方法;实 验 流 程;第一部分 细胞总RNA的提取;操作步骤 ;原 理;原 理：Trizol的主要成分;在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA在上层水相中。 取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA；用乙醇沉淀中间层可回收DNA；用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质。;仪器和主要试剂;;所有ＲＮＡ的提取过程中都有五个关键点： 样品细胞或组织的有效破碎； 有效地使核蛋白复合体变性； 对内源ＲＮＡ酶的有效抑制； 有效地将ＲＮＡ从ＤＮＡ和蛋白混合物中分离； 对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。 ;RNA酶污染来源;防止RNA酶污染的措施 ;RNA完整性检测;RNA降解 A.组织取出后没有马上处理或冷冻。 B.待提取RNA的样品没有保存于-60至-70℃，而保存在了-5至-20℃。 C.细胞在用胰酶处理时过度。 D.溶液或离心管未经RNase去除处理。 E.电泳时使用的甲醛pH值低于了3.5 。 DNA污染 A.样品匀浆时加的试剂量太少 B.样品中含有有机溶剂(如乙醇，DMSO等)，强缓冲液或碱性溶液;第二部分逆转录-聚合酶链反应 (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR);仪器和主要试剂;操作步骤;取0.2 ml PCR反应管一只，用微量加样枪分别加入各试剂： ;提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。 RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。 该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。;RT-PCR-逆转录-聚合酶链反应 ;鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶H活性相对较弱。最适作用温度为37℃。在长时间的逆转录过程中，不会造成模板的降解，获得cDNA的几率大，适用于较长的cDNA链的合成。 禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶：有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。最适作用温度为42℃。 Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在Mn2+存在下，允许高温反转录RNA，以消除RNA模板的二级结构。 MMLV反转录酶的RNase H-突变体：商品名为Superscript 和SuperScriptⅡ。此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的mRNA模板合成较长cDNA。;随机六聚体引物：用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA。 Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的方法。因绝大多数真核细胞mRNA具有3’端Poly(A+)尾，此引物与其配对，仅mRNA可被转录。由于Poly(A+)RNA仅占总RNA的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。 特异性引物：是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的PCR扩增。 ;PCR 反应系统的组成;（一）模板 单、双链DNA均可。 不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。 一般100ng DNA模板/100?L。 模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。;(二)引物 引物的设计：使用引物设计软件NTI 9.0,PRIME 5.0等 长度一般最低不少于16个核苷酸，而最高不超过30个核苷酸，最佳长度为18～21个核苷酸。有时可在5’端添加不与模板互补的序列，如限制性酶切位点等，以完成基因克隆和其它特殊需要。 两个引物之间不应发生互补，特别是在引物3’端，即使无法避免，其3’端互补碱基也不应大于2个碱基，否则易生成“引物二聚体”或“引物二倍体”（Primer dimer）。 引物内部应避免内部形成明显的次级结构，尤其是发夹结构（hairpin structures）。 (G+C）%含量:引物的组成应均匀，尽量避免含有相同的碱基多聚体。两个引物中（G+C）%含量