常用分子生物学技术-2016ly.pptVIP

（三）染色质免疫沉淀分析 利用免疫沉淀的原理共沉淀蛋白质与染色质结合的复合物，研究蛋白质与DNA的相互作用。 * 二、蛋白质与蛋白质相互作用 （一）酵母双杂交技术（yeast two-hybrid technique） GAL4包括两个彼此分离的但功能必需的结构域： DNA结合域（BD）和转录激活域（AD）。DNA-BD能够识别位于GAL4效应基因的上游激活序列(Upstream activating sequence,UAS)并与之结合。而AD则通过与转录机构中的其他成分之间的结合作用，以启动UAS下游的基因进行转录. DNA-BD和AD单独分别作用并不能激活转录反应，但是当二者在空间上充分接近时，则呈现完整的GAL4转录因子活性并可激活UAS下游启动子，使启动子下游基因得到转录。 * Fields建立了一个双杂交系统，BD与X蛋白融合，AD与Y蛋白融合，如果X、Y之间形成蛋白-蛋白复合物，使GAL4两个结构域重新构成，则会启动特异基因序列的转录. 他们利用Snf1与Snf4的相互作用， 将Snf1与BD融合，Snf4与AD融合，构建在穿梭质粒上. 其中Snf1是一种依赖于丝氨酸、苏氨酸的蛋白激酶，Snf4是他的一个结合蛋白. 研究者将二种穿梭质粒转化酵母GGY：171 菌株，该菌株含有LacZ报告基因，并已去除相应转录因子基因. 该实验的结果表明由Snf1和Snf4相互作用使得AD和BD在空间上接近，激活了报告基因LacZ的转录. 一般地，将BD-X的融合蛋白称作诱饵（bait),X往往是已知蛋白，AD-Y称作猎物（prey），能显示诱饵和猎物相互作用的基因称报告基因，通过对报告基因的检测，反过来可判断诱饵和猎物之间是否存在相互作用 * * A. The Gal4 transcription factor gene produces a two-domain protein (BD and AD) essential for transcription of the reporter gene (LacZ). B,C. Two fusion proteins are prepared: Gal4BD+Bait and Gal4AD+Prey. Neither of them are usually sufficient to initiate transcription (of the reporter gene) alone. D. When both fusion proteins are produced and the Bait part of the first fusion protein interacts with the Prey part of the second, transcription of the reporter gene occurs. (二) 串联亲和纯化(tandem affinity purification, TAP) 构建含有目的基因的载体，使目的基因与2个不同的表位标签融合表达，如Flag、HA、His、CBP、SBP等等。 采用Flag-HA双标签载体；载体转染细胞并表达融合蛋白“Flag-HA-诱饵蛋白”；细胞裂解提取总蛋白，经anti-flag树脂和anti-HA树脂的两步纯化和洗脱，更大限度了去除了假阳性蛋白。洗脱液进入质谱仪，分析鉴定与诱饵蛋白具有相互作用的蛋白。 * * (三) 免疫共沉淀（co-immunoprecipitation，co-IP） 利用加入与蛋白质间相互作用的诱饵蛋白的抗体产生免疫沉淀反应，使与诱饵蛋白稳定结合的猎物蛋白共沉淀。 * （四）表面等离子共振（surface plasmon resonance，SPR） 利用入射光以临界角入射到两种不同折射率的介质表面时所引起金属自由电子的共振而使反射光在一定角度内大大减弱甚至完全消失的物理现象，从而获取生物分子间相互作用过程中样品的折射率与共振角的动态变化。 * * 特异性强 灵敏度高 操作简单、省时 对待检原始材料质量要求低 高效率的基因扩增技术 ——应用PCR技术可以使特定的基因或DNA片段在短短的2－3小时内体外扩增数十万至百万倍。 * 一、基因敲除的一般原理 利用胚胎干细胞进行基因敲除。1）构建常规基因敲除载体，载体中的外源基因与靶基因高度同源，且被修饰和改造；2）敲除载体质粒导入胚胎干细胞；3）筛选发生同源重组的阳性胚胎干细胞；4）通过显微注射将阳性胚胎干细胞导入胚囊；5）转入假孕雌鼠子宫；6）获得嵌合体小鼠。 * 129 C57BL/6 野灰色对黑色是显性 基因敲除的一般原理 发生在同源序列间的重组称为同源重组(homologous recombination)，又称基本