《生物制药技术 叶丽老师》动物细胞和转基因动物制药.pptVIP

原核表达 优点：操作简单、效率高、成本低。 缺点；（1）由于原核与真核系统的差异，某些真核生物的蛋白不能表达或表达量低； （2）细菌内大量表达的蛋白容易形成包涵体而难以提纯； （3）不能正确修饰：糖基化、羧基化等而影响蛋白的活性； （4）细菌表达的蛋白作为药物使用时可产生过敏反 应。 真核细胞表达 高等动物细胞等真核表达系统也已广泛用于制药行业，其优点在于很大程度上克服了细菌的原核表达系统的一些缺点。但真核细胞表达系统也有其不足之处如：对培养条件的要求苛刻，需要高容量、高效的动物细胞发酵罐，扩大培养困难，成本太高，且易污染。 转基因动物生物反应器 重组蛋白的表达系统 禽卵 哺乳动物血液 哺乳动物尿液 哺乳动物精液 哺乳动物乳汁 转基因动物的获得 受精卵 配子（精子或卵母细胞） ES细胞 体细胞 生物反应器—禽卵 特点： 一种新型的白来杭鸡年产蛋可达330只，每只蛋约含6.5g蛋白，其中属于卵清部分的就有3.5g。 卵黄蛋白进入卵黄需要特定的内部识别序列，所以对卵清蛋白基因修饰更容易些。 蛋清的产量高、蛋白含量丰富且产物分泌到动物体外，且家禽在传代时间和实验成本上拥有优势。 难点： 缺少有效的转基因途径，因而进展缓慢。 最新报道： Harvey等于去年4月的《Nature Technology》上宣布，利用复制缺陷型的禽白血病病毒(ALV)，将β-内酰胺酶基因导入来杭鸡体内，获得嵌合体公鸡。经过几代的近交、选育，最终得到蛋中能含有β-内酰胺酶的纯合母鸡。蛋清中β-内酰胺酶含量在0.25到1.65μg/ml之间 生物反应器—血液 特点 许多蛋白在血浆中很不稳定，甚至有些蛋白对动物的健康不利。 血液也许只适合生产人血红蛋白、抗体或非活性状态的融合蛋白。 目前研究显示：网织红细胞也许能成为非分泌型重组蛋白的“工厂”。 几例较成功的报道： —————————————————— 作者 　　　受体动物 表达环境 目标蛋白 ———————————————————————— Massoud等 　家兔 血浆 　　α1-抗胰蛋白酶 Lo等　　　　　 猪 血浆 　　　重组抗体 Limonta等 　家兔 血浆 　　　重组抗体 Tomizuka等　　 小鼠 血浆 　　　人源抗体 Sharma等 　猪　网织红细胞 人血红蛋白 —————————————————— 生物反应器—尿液 特点 收集产物蛋白比较容易，不必对动物造成伤害。 从动物一出生就可收集产物，不论动物的性别和是否正处于生殖期。 尿液中杂蛋白及脂类含量极低，重组蛋白的分离纯化就简单的多。 二例成功的报道： —————————————————————————————— 作者 　　　表达基因 　　调控序列　　表达位置 表达量 —————————————————————————————— Ryoo等 　　　hGM-CSF 　uroplakinⅡ 　小鼠膀胱 180ng/ml Bikowska等 AAT 　　　uromodulin 小鼠肾脏 65μg/ml ——————————————————— 生物反应器—乳腺 特点 产量高、成本低、周期短，效率高； 英国PPL公司转基因羊生产α1-抗胰蛋白酶，一升羊奶中含蛋白30克，价值4000英镑，成本0.05美元/每克蛋白，而细胞培养法5-500mg/L，4-10美元/每克蛋白。荷兰PHP公司三头转基因牛生产的EPO可供全球所用。 乳腺表达、不影响动物整体； 能弥补其它表达系统的不足，对蛋白可进行翻译后修饰加工。 从乳汁中纯化蛋白技术简单，不污染环境。 改变乳汁成份，作为保健食品。 受体动物的选择 从理论上讲，外源基因可以转导到任何一种动物的生殖系细胞中获得转基因动物，但能否开发成转基因动物生物反应器以生产药物蛋白质，则须考虑技术和经济等因素。至少要重点考虑以下几点： 动物世代间隔的长短; 窝产数多少; 乳腺反应器泌乳量; 动物维持成本; 抗病毒感染能力. 表2 转基因动物生产蛋白药物的比较 ——————————————————————— 小鼠 兔 猪 山羊 绵羊 奶牛 ——————————————————————————— 年产奶量（升/只） 0.02 50 250 400 500 10000 生产10公斤药物蛋 白所需动物数 5.8×106 200 40 25 20 1 转基因动物首次泌 乳所需时间 14 周 17周 12月 18月 18月 2