《生物制药技术 叶丽老师》基因工程制药.pptVIP

（三）影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素 外源基因的拷贝数 外源基因的表达效率 表达产物的稳定性 细胞的代谢负荷 工程菌的培养条件 1 外源基因的拷贝数 载体拷贝数决定着外源基因的拷贝数 外源基因克隆到高拷贝数质粒上→ 表达质粒拷贝数增加→外源基因拷贝数增加→基因表达产物增加 2 外源基因的表达效率 启动子的强弱 核糖体结合位点的有效性 SD序列和起始密码子ATG的间距 密码子的组成等 3 表达产物的稳定性 组建融合基因，产生融合蛋白 把真核基因产物运输到胞浆周质的空隙中，或分泌至培养基中 采用位点特异性突变方法，改变真核蛋白二硫键的位置，从而增加蛋白的稳定性。 选用蛋白酶缺陷型宿主菌，减弱表达产物的降解。 共表达能提高特定目标蛋白的稳定性的辅助因子，如蛋白分子伴侣等。 4 细胞的代谢负荷影响： 外源基因表达产物可能对宿主有毒性。 大量的外源产物可能打破宿主细胞的生长平衡。 宿主细胞的代谢受阻，反过来会影响外源基因的表达。 采取的措施： 细胞生长和外源基因的表达分为两个阶段：细胞生长期，外源基因表达期。 细胞的生长与重组质粒的复制分开 5 工程菌的培养条件 培养基的组成 温度 pH 培养时间 …… 真核基因在大肠杆菌中的表达形式 包涵体颗粒 以融合蛋白的形式表达外源基因 以非融合蛋白的形式表达外源基因 分泌型表达外源基因 包涵体 1）包涵体的定义、组成与特性： 包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。 一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、内毒素、外膜蛋白环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等 大小为0.5-1um，具有很高的密度（约1.3mg/ml），无定形，呈非水溶性，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。 NMR等新技术的应用表明包涵体具有一定量的二级结构，他们可能在复性的启动阶段中具有一定的作用。 2）包涵体的形成： 主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。 基因工程菌的表达产率过高，超过了细菌正常的代谢水平 重组蛋白的氨基酸组成 重组蛋白所处的环境 重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类和辅助因子，如折叠酶和分子伴侣等，致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。 蛋白质在合成之后，于中性pH或接近中性pH的环境下，其本身固有的溶解度对于包涵体的形成比较关键，即是说，有的表达产率很高，如Aspartase和Cyanase,表达产率达菌体蛋白的30%,也不形成包涵体，而以可溶形式出现。 在细菌分泌的某个阶段，蛋白质分子间的离子键、疏水键或共价键等化学作用导致了包涵体的形成。 包涵体优点： ※ 表达载体构建简单 ※ 表达量高 ※ 可表达对宿主细胞有毒或有致死作用的蛋白质 ※ 能避免细胞内蛋白水解酶的作用 ※ 有利于目的蛋白的富集和分离纯化 缺点： ※ 要用变性剂溶解，再复性才能得到溶解性蛋白质 ※ 处理后的蛋白质不一定能完全恢复生物学活性 ※ 处理工艺使蛋白质制备成本上升 融合蛋白（fusion protein） 表达的蛋白质或多肽的N末端由载体DNA编码,C末端由克隆的外源DNA编码. 优点： ※ 稳定 ※ 如果载体编码的是一段信号肽，则可产生分泌型表达产物 ※ 可用亲和层析纯化表达产物 ※ 用蛋白酶切获得表达产物 非融合蛋白 是指在大肠杆菌表达的蛋白以真核蛋白的mRNA的AUG为起始，其氨基端不含原核序列. 表达载体的操纵子必须改建：启动子—细菌核糖体结合位点（SD序列）--真核基因起始密码子—结构基因—终止密码。要求SD与ATG之间距离合适。 优点：较好的保持原来蛋白的活性。 缺点：易被蛋白酶破坏。非融合蛋白N端有甲硫氨酸，人体用药时可能引起免疫反应。 分泌型蛋白 外源蛋白可分泌到细菌细胞的周质空间或直接分泌到培养基中. 可避免表达产物的降解 有些蛋白能按一定方式折叠，在胞内表达无活性时分泌表达有活性 分泌产物不含ATG编码的Met。 方便纯化表达产物 应用：利用大肠杆菌重组表达人胰岛素 DNA （3个外显子，2个内含子） mRNA （前胰岛素原 109个aa残基） 穿过内质网膜，N-端23 aa残基切除 胰岛素原 胰岛素原由三部分构成：N端，B链 30 个aa残基 C端：A链，21 个aa残基。中间：C链 32个aa残基 蛋白酶 胰岛素 A,B两链，3个二硫键交叉连接 2 胰岛素的基因工程 两条途径 分别在大肠杆菌中合成A链和B链，再用化学方法连接成胰岛素 重组生产胰岛素原，再用酶加工成胰岛素 1）分别表达A,B链 2）重组表达胰岛素原 提取胰岛素原的mRNA 反转录酶