敬兴果《核医学精品课件》02.体外分析技术.pptVIP

体外分析技术 第 一 节 放射免疫分析法 (Radioimmunoassay) 一、基本原理 二、基本方法 （一）基本试剂 二、基本方法 二、基本方法 （二） B和F的分离 三、质量控制（quality control） 1、精密度（precision） 变异系数（ CV ）7%~10% RIA 小 结 灵敏度高 特异性好 精确的定量 方法操作简便 第二节 免疫放射分析法 第三节 非放射性标记免疫分析技术 时间分辨荧光免疫分析技术（time-resolved fluoroimmunoassay） 一、基本原理 时间分辨荧光检测的基本原理示意图 二、TrFIA的特点 1、最大限度提高测量方法的灵敏度 2、有与RIA相似的特异性和精密度 3、可同时测定两种以上的抗原 4、无辐射污染 体外分析技术 体外放射分析 体外非放射分析 放射性竞争结合分析 放射性非竞争结合分析 放射免疫分析 免疫放射分析 酶免疫分析 化学发光免疫分析 荧光免疫分析 (RIA) (IRMA) (EIA) (CLIA) (FIA) 利用放射性核素标记的示踪剂在体外测定从体内采取的样品中的微量生物活性物质的含量 Dr. Yalow Ag-Ab + Ag *Ag Ab Ag + + *Ag-Ab + *Ag (B) (F) *Ag与Ag的免疫活性相同 *Ag＋Ag Ab Ag= * Ag , AgAb=*AgAb Ag *Ag , *AgAb (B) *Ag(F) Ag *Ag , *AgAb (B) *Ag (F) Ag *Ag Ab *AgAb AgAb *Ag + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + Ag 25 50 100 200 400 800 *Ag Ab 分离B、F B%=B/(B+F) F%=F/(B+F) R=B/F B1% B2% B3% B4% B5% B6% 1 2 3 4 5 6 浓度 B% 标 准 曲 线 Ag 25 50 100 200 400 800 *Ag Ab 分离B、F B1% B2% B3% B4% B5% B6% 1 2 3 4 5 6 B% ？ 在体外条件下, Ag与定量的*Ag对限量的特异性Ab的竞争结合反应。 B% F% B/F 1.0 2.0 Calibration Curve 60 1、抗体 2、标记抗原 3、非标记标准抗原（标准品） 1、抗体 1）亲合常数K （affinity constant K） 反应抗体与抗原的结合能力 2）交叉反应率 反应抗体的specificity 3）滴度 (titer) 抗体的稀释倍数 B/F 0.5 1.0 复合物浓度 1 2 3 · · · · · 斜率= -K 10 100 1000 10000 100000 Ab稀释度 工作滴度 高亲和力 高特异性 高滴度 Scatchard作图 二、基本方法 （一）基本试剂 1、抗体 2、标记抗原 3、非标记抗原（标准品） 2、标记抗原 1）比活度和放化纯度足够高 比活度——每微克抗原上标记放射性核素的千贝可数（KBq/μg） 放化纯度——具有免疫活性的标记抗原占总放射性的百分数。 90% 2）半衰期足够长 3）保持原有抗原的特性 125I—大分子、3H or 125I—小分子 （一）基本试剂 1、抗体 2、标记抗原 3、非标记抗原 （标准品） 化学结构、免疫活性与被测抗原相同 高纯度 1、第一类 2、第二类 双抗体沉淀法 PEG沉淀法 固相第二抗体法 + Ag Ab(1) Ab(2) 试管 Ab(2) Ab(1) Ag 可溶性复合物 可沉淀复合物 2、准确度（accuracy） 回收率=测定值/真实值×100% 90%~110% 3、灵敏度 （sensitivity） 方法的最小可测量 4、特异性（specificity） 交叉反应率 5、健全性（perfectly） 平行性试验 6、稳定性（stability） B0%，NSB，ED25，ED50，ED75 A B C *Ab + Ag-*Ab + *Ab （immunoradiometric assay,IRMA） B% Ag （B） （F） IRMA与RIA工作原理的主要区别 低剂量区无不确定因素 低剂量区有不确定因素 非特异结合主要影响低剂量区 非特异结合主要影响高剂量区 反应到达平衡快 反应到达平衡慢 Ag*Ab的量与待测Ag的量 呈正相关 *AgAb的量与待测Ag的量 呈负相关 所用抗体是过量的 所用抗体是限量的 二种主要反应试剂 三种主要反应试剂 采用标记抗体 采用标记抗原 非竞争性抗原抗体结合反应 竞争性