细菌耐药性进化的代谢约束.PDF

细菌耐药性进化的代谢约束 周开银 2017年10月30 一、背景 • 代谢通量：反应底物分配在各代谢途径上的反应物的量；也可以指各代谢途径上的 反应速率。 • 基于限制的通量平衡分析（Flux balance analysis，FBA） 通量平衡分析方法使用数学上的最优化理论解决生物问题，计算最优的目标函数值以及在目标 函数下最优解的集合。从生物的角度来说是根据代谢反应的化学计量学信息以及稳态下的代谢 物质量守恒定律使用数学上的线性规划( Linear programming，以下简称LP) 来求解通量分布。 • E. coli MG1655 genome-scale metabolic model ：将生物体所有相关的代谢信息用数 学模型进行模拟通常表现为网络形式。 二、研究内容 • 研究两种不同的营养条件下大肠杆菌耐药性进化过程中的代谢变化； • 以大肠杆菌全基因组代谢模型为基础结合基于限制的通量（flux）平衡分析方法 并引入影子价格的概念提出新的建模方法； • 利用该模型结合耐药群体的基因组测序结果研究耐药性与补偿机制之间的关系； 一、耐药性突变的产生和代谢分析 试验一： 目的：研究耐药性进化与细菌生长环境之间的关系 方法：三种抗生素—四种柱系（E.coli ）—两种碳源（Glu,Ace ）—连续传代培养（150-160）—对 照组 结果： 1、两组不同营养条件下的菌株突变率相同（Dataset EV1）； 2、同一抗生素条件下以葡萄糖为唯一碳源的菌株获得耐药 性的速度要快； 结论：表明环境条件（Glu,Ace ）影响耐药性获得的速率（图C ） 试验二： 目的：弄清代谢影响细菌耐药进化的深层机制 方法： • 沿进化轨迹选取8个进化群体，每个群体包含24个柱系共192个群体 • 无抗生素基本培养基上培养指数期取样 • 细胞内和细胞外代谢物用质并用质谱检测，分别发现413和392个离子 • 根据测得的离子精确质量推测出分别有586和553种代谢物 结果： • 仅经过数代（30-50代）细胞 内外的代谢物就发生巨大变化 （图A，图B） • 相同选择压下这种代谢变化是高度可复 制的 （图A） 分析： • 这里耐药群体表现出普遍的代谢改变， 表明耐药群体代谢适应的改变是由相应 的抗生素驱动的与碳源无关（图A ，图B） • 为了排除这种代谢改变可能的随机性， 用S型曲线拟合相对代谢丰度（代谢从初 始状态变化到了新的稳定状态）（图C ） • 葡萄糖中细菌代谢物的改变量要比乙酸 盐中代谢物的改变大（图D） • 葡萄糖为唯一碳源时细菌耐药进化速率 快（试验一），代谢物改变量大，这反 映了细菌在葡萄糖条件下高度自由的呼 吸发酵分解代谢，所以很有可能细菌在 通过改变代谢来提高自己的耐药性。 （图D） 二、通过基于限制的建模方法来解释代谢状态的改变 实验一： 目的：构建模型来描述耐药细胞的代谢状态的改变 理念：之前的实验表明通量的改变通常伴随代谢丰度的改变。因此作者假设进化菌株代谢 浓度的改变反映了一种将细胞内通量重定向到特定的但是未知的代谢目标上从而来驱动和 补偿细菌的耐药进化。 方法： • 通过改变大肠杆菌全基因组代谢模型的每一个单独反应来最小化或者最大化细胞代谢通 量 • 对于每一个反应计算影子价格（评价目标函数（反应通量）对可获得所有单独代谢产物 的灵敏度），影子价格为负数，说明该代谢物是整个反应的限制因素 • 通过置换检验换挑选出 耐药进化过程中实验的发现被改变的代谢物中影子价格为负的 代谢物被过多表达 的反应（也就是说挑选出明显受代谢物限制的代谢反应） • 通过系统的搜索这些限制性代谢物明显变化的反应，如过这些反应在耐药进化和耐药补 偿中起到积极作用作者就将其作为代谢参数。并且将这些限制性的代谢反应称为 EMCs(进化的代谢特征) 三、利用模型结合耐药群体的基因组测序结果研究耐药性与补偿机制 之间的关系 结果：