- 1、本文档共132页,可阅读全部内容。
- 2、原创力文档(book118)网站文档一经付费(服务费),不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
- 3、本站所有内容均由合作方或网友上传,本站不对文档的完整性、权威性及其观点立场正确性做任何保证或承诺!文档内容仅供研究参考,付费前请自行鉴别。如您付费,意味着您自己接受本站规则且自行承担风险,本站不退款、不进行额外附加服务;查看《如何避免下载的几个坑》。如果您已付费下载过本站文档,您可以点击 这里二次下载。
- 4、如文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“版权申诉”(推荐),也可以打举报电话:400-050-0827(电话支持时间:9:00-18:30)。
查看更多
8.蛋白质的分离纯化-王镜岩生物化学(全)教学教案.ppt
第 七 章
蛋白质的分离、纯化和表征 ; 研究蛋白质的结构、性质和活性蛋白质的功能,首先需要得到纯的、没有变性的蛋白质样品。
分离和纯化蛋白质的各种方法主要是利用蛋白质之间各种特性的差异,包括:
1.分子的大小和形状、
2.酸碱性质、
3.溶解度、
4.吸附性质
5.对配体分子的特异生物学亲和力。 ;第一节
蛋白质的酸碱性质 ; 蛋白质的等电点; 蛋白质的电泳;电泳;第二节 蛋白质分子大小的测定;常用测定方法:;二、凝胶过滤法测定相对分子质量;;分子筛色谱
(凝胶过滤);利用Andrews的实验经验式:
logMr = a/b—Ve/bVo
Ve(elution volume)为某一溶质组分的洗脱体积。它是自加样品开始到该组分的洗脱峰(峰顶)出现时所流出的体积。
V0 (outer volume)为外水体积,即存在于柱床中凝胶珠外孔隙的水相体积。测定出不能被凝胶滞留的大分子溶质如蓝色葡聚糖—2000的洗脱体积可以决定V0。 ;logMr;三、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定相对分子质量; 如果在聚丙烯酰胺凝胶系统中加入阴离子去污剂十二烷基硫酸钠(SDS)和少量巯基乙醇,单体蛋白质或亚基的多肽链处于伸展状态,此时SDS以其烃链与蛋白质分子的侧链结合成复合体。结果:1、所有的SDS-蛋白质复合体都具有相同的荷质比。2、具有相同的构象。因此蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的相对分子质量,而与原来所带的电荷和分子形状无关。 ;; 在聚丙烯酰胺凝胶中由于引入凝胶的分子筛效应,电泳迁移率与多肽链分子量的对数有下列关系:
log Mr = a—bμR
式中Mr为相对分子质量,a、b都是常数,μR是相对迁移率:
μR = 样品迁移距离/前沿(染料)迁移距离;; 实验测定时,以几种相对分子质量标准物蛋白质的Mr的对数值对其μR值作图,根据待测样品的μR,从标准曲线上查出它的Mr。;最准确可靠的方法是超离心法(Svedberg于1940年设计):蛋白质颗粒在25~50*104 g离心力作用下从溶液中沉降下来。;蛋白质分子量(M)与沉降系数(s)的关系;第三节
蛋白质的胶体性质
与蛋白质的沉淀
;一、蛋白质的胶体性质 ;A、分散相的质点大小在1-100nm范围内。动力学上稳定,能作不断的布朗运动。
真溶???(1nm) 胶体溶液 悬浮液(100nm)
B、分散相的质点带有同种电荷,互相排斥,不易聚集成大颗粒而沉淀。
C、分散相的质点能与溶剂形成溶剂化层(如水化层);蛋白质溶液性质:
1、蛋白质分子颗粒在1-100nm范围内。
2、形成水化层:分子表面上亲水基团在水溶液中能与水分子起水化作用
3、构成稳定的双电层:分子表面上的可解离基团,在适当的pH条件下,都带有相同的净电荷,与其周围的反离子构成稳定的双电层。;+;4、蛋白质溶液也和一般的胶体系统一样具有丁达尔效应、布朗运动以及不能通过半透膜等性质
由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透膜,因此可以应用透析法将非蛋白的小分子杂质除去。;二、蛋白质的沉淀 ;在温和条件下,通过改变溶液的pH或电荷状况,使蛋白质从胶体溶液中沉淀分离。
在沉淀过程中,结构和性质都没有发生变化,在适当的条件下,可以重新溶解形成溶液,所以这种沉淀又称为非变性沉淀。
可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基本方法,如等电点沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等。;在强烈沉淀条件下,不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性,而且也破坏了蛋白质的结构和性质,产生的蛋白质沉淀不可能再重新溶解于水。
由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的变化,所以又称为变性沉淀。
如加热沉淀、强酸碱沉淀、重金属盐沉淀和生物碱试剂沉淀等都属于不可逆沉淀。;沉淀蛋白质的方法有以下几种:
(1) 盐析法 : 向蛋白质溶液中加人大量的中性盐(硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等),使蛋白质脱去水化层而聚集沉淀。盐析沉淀一般不引起蛋白质变性。当除去盐后,又可溶解。; (2) 有机溶剂沉淀法
极性有机溶剂(甲醇、乙醇或丙酮等),因引起蛋白质脱去水化层以及降低介电常数而增加带电质点间的相互作用,致使蛋白质颗粒容易凝集而沉淀。;
(3) 重金属盐沉淀法
(4) 生物碱试剂和某些酸类沉淀法
(5) 加热变性沉淀法
几乎所有的蛋白质都因加热变性而凝固。原因可能是由于热变性是蛋白质天然结构解体,疏水基外露,因而破坏了水化层,同时由于蛋白质处于等电点也破坏了带电状态(当处于等电点时)。
; 少量盐类促进蛋白质的加热凝固。(豆腐)我国很早就创造了将大豆蛋白质的浓溶液加热并点入少量盐卤(含MgCl2)的制豆腐的方法,这是成功的应用加热变性沉淀蛋白质的一个例子。
;点卤时,由于
您可能关注的文档
- 6.3三重积分的计算培训资料.ppt
- 6.3当代资本主义的新变化教学教案.ppt
- 6.3生产过程的核算培训资料.ppt
- 6.4常见的组织结构形式-讲课稿培训资料.ppt
- 6.5不同规模城市服务功能的差异教学教案.ppt
- 6.5两、三位数加三位数的笔算(不连续进位)演示教学.ppt
- 6.丰富多彩的语言----修辞教学教案.ppt
- 6.画一幅色彩和谐的画 人美版六年级上培训资料.ppt
- 6.雅典城邦的民主政治培训资料.ppt
- 62每个人的责任教学教案.ppt
- 四川省遂宁市射洪中学2023-2024学年高一下学期期末模拟数学试题(含答案).pdf
- 四川省遂宁市射洪中学2023-2024学年高一下学期期末模拟物理试题(含答案).pdf
- 四川省遂宁市射洪中学2023-2024学年高一下学期期末模拟英语试题(含答案,含听力原文,无音频).pdf
- 2024上海电力大学教师招聘考试笔试试题.docx
- 2024江苏警官学院教师招聘考试笔试试题.docx
- 2024上海戏剧学院教师招聘考试笔试试题.docx
- 2024上海交通大学教师招聘考试笔试试题.docx
- 2024上海公安学院教师招聘考试笔试试题.docx
- 2024上海兴伟学院教师招聘考试笔试试题.docx
- 2024上海师范大学教师招聘考试笔试试题.docx
最近下载
- 《矿山企业温室气体排放核算方法与报告指南(试行)》.docx
- JGJ_T496-2022 房屋建筑统一编码与基本属性数据标准.docx
- [金属冶金标准]GBT 14506.8-2010 硅酸盐岩石化学分析方法 第8部分:二氧化钛量测定.pdf
- 掘进安全管理课件.pptx
- 钢平台验收记录表.docx
- IPC-2221C-EN TOC2023印制版设计通用标准 Generic Standard on Printed Board Design.pdf
- 小学数学《图形的运动》作业设计.docx
- 看课件-成人气道异物梗阻救护.ppt
- 中职旅游类《前厅服务与管理》职教高考必备试题库(含答案).docx
- 公务员平时考核评鉴表(空表).pdf VIP
文档评论(0)