血红蛋白的提取与分离!2014.10.22精品.pptVIP

1.洗涤红细胞 阅读思考：洗涤的目的是什么？ 除去其中的杂蛋白，以利于后续血红蛋白的分离纯化 2.释放血红蛋白 阅读思考： 释放血红蛋白过程中，在洗涤好的红细胞加入 了哪些物质？ 2.为了加速释放过程，采取了什么措施？ 目的分析： 蒸馏水的作用是______________________________。 加入甲苯的作用是____________________________。 充分搅拌的目的是____________________________。 使红细胞大量吸水胀裂 溶解红细胞的细胞膜 加速红细胞的破裂 蒸馏水和甲苯 3.分离血红蛋白 分离过程 红细胞破 碎混合液 高速离心 10min 离心管 滤纸 过滤 脂类物质 烧杯 2000r/min的速度 3、分离血红蛋白溶液 有机溶剂 无色透明的甲苯层 脂类物质 白色脂溶性物质沉淀层 血红蛋白溶液 红色透明液体 红细胞破碎物沉淀 暗红色沉淀物 4、透析----血红蛋白的粗分离： ①过程：取1ml的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透 析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为20mmol/l的 磷酸缓冲液中（pH为7.0），透析12小时。 ②透析目的：除去样品中分子量较小的杂质。 实验操作 原理：透析袋能使小分子自由进出，而大分子保留在袋内。 透析过程动画演示 （二）纯化——凝胶色谱法 1.凝胶色谱柱的制作 2.凝胶色谱柱的装填 3.样品的加入和洗脱 1、凝胶色谱柱的制作： 实验操作： 样品处理→粗分离→纯化→纯度鉴定 色谱柱的制作过程：准备材料→加工橡皮塞 →安装色谱柱 2、凝胶色谱柱的装填 步骤 ① 操作要求 不能有气泡存在 ② 计算称量凝胶 ③ 配制悬浮液 ④ 装填悬浮液 ⑤ 缓冲液洗涤平衡 注意：正确的加样操作（1）不要触及和破坏凝胶面（2）贴壁加样（3）使吸管管口沿管壁环绕移动。 3、样品加入与洗脱 装配好的凝胶柱 （三）纯度鉴定 SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳 使用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的分子量时，可选用一组已知分子量的标准蛋白同时进行电泳，根据已知分子量的标准蛋白的电泳区带位置，用电泳迁移率和分子量的对数作标准曲线，可以测定未知蛋白质的分子量。 收集得到的纯化后的蛋白 观察你处理的血液样品离心后是否分层（见教科书图5-18），如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。 三.实验结果分析与评价 1、你是否完成了对血液样品的处理？你能描述处理后的样品发生了哪些变化吗？ 由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可以加入大分子的有色物质，例如蓝色葡聚糖—2000或红色葡聚糖，观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。 2、你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你的色谱柱装填得成功吗？你是如何判断的？ 如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。 3、你能观察到蛋白质的分离过程中，红色区带的移动吗？请描述红色区带的移动情况，并据此判断分离效果？ 本课要点; 1.凝胶色谱法分离蛋白质的的原理是怎样的? 2.什么是缓冲溶液?它的作用是什么? 3.电泳的作用及其原理是什么? 4.你能描述血红蛋白分离的完整过程吗? 5.与其他真核细胞相比,红细胞有什么特点?这一特点对你进行 蛋白质的分离有什么意义? 血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。 思考 1、在装填凝胶柱时，不能有气泡存在的原因是 A、气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次 序，降低分离效果 B、气泡阻碍蛋白质的运动 C、气泡与蛋白质发生化学反应 D、气泡在装填凝胶的时候，使凝胶不紧密 2、样品的加入和洗脱的操作不正确的是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 A． 加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到凝胶面的下面 B．加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内 C．等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口 D．用吸管小心的将1ml透析后的样品加到色谱柱的顶端，不要破坏凝胶面 3、下列是有关血红蛋白提取和分离的相关操作，其中正确的是（