食品生物应用技术知识第二章 -01节-基因工程概述及其工具酶.pptVIP

第二章 基因工程及其在食品科学中的应用;第一节 基因工程基础;（三）基因工程的研究内容 ;;二、基因工程的工具酶 基因工程的关键技术之一就是先将目的基因DNA从供体生物体中分离出来，再与合适载体DNA连接重组等，这些分子操作涉及多种不同的酶。主要包括： 限制性内切核酸酶 DNA甲基化酶、 DNA聚合酶 依赖于DNA的RNA聚合酶 连接酶 激酶 磷酸酶 核酸酶 ;（一）限制性内切核酸酶与DNA甲基化酶 1、定义 restriction endonuclease：指一类能够识别和切割双链DNA分子内核苷酸序列的内切核酸酶 DNA methylase ：是指一类能够识别DNA特定序列，并在其特定碱基的特定位置上引入甲基而发生修饰作用的酶 2、限制性酶（甲基化酶）的命名和分类 (1) 限制酶(甲基化酶)的命名 其命名主要是参照H．O．Smith和D. Nathans提出的待命名酶的供体微生物的属名与种名相结合的原则进行的，具体如下： ;① 以属名的第一个字母(大写)和种名的最前两个字母(小写)组成的三字母符号为其基本形式 如：来源于大肠杆菌(Escherichia coli)的酶用Eco表示；来源于流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)的用Hin表示 ② 当同属不同种的两种微生物的种名前两个字母完全相同时，则来自后一种微生物的酶的符号改用其种名词头前缀后第一个字母(小写)代替上述三字母符号中的最后一个字母 如：来自Haemophilus parainfluenzae (副流感嗜血杆菌)的用Hpa表示，．而来自同一属的Haemophilus parahaemolyticus (副溶血嗜血杆菌)的则用Hph表示。;(2) 限制酶的分类 根据酶的性质，可将限制酶分为三个类型: I型: 三种不同亚基组成；辅助因子为ATP、Mg2+及S-腺苷甲硫氨酸 其切割位点距其识别位点至少1000bp；且切割作用是随机的 Ⅱ型: 两个相同亚基组成；辅助因子仅为Mg2+；其识别位点常具旋转 对称性；其切割位点与其识别位点重叠或在其附近；且切割作 用特异性强 Ⅲ型: 两种不同亚基组成；辅助因子为ATP和Mg2+，也受S-腺苷甲硫 氨酸激活，但并非必需；其切割位点一般在距其识别位点3’端 24～26bp处 ;PstI 5’-C TGCA ↓ G-3’ 3’-G ↑ ACGT C-5’ HpaI 5’-GTT ↓ AAC-3’ 3’-CAA ↑ TTG-5’ ; (3)Ⅱ型限制性内切核酸酶的基本特性 ① 识别序列与切割位点 Ⅱ型限制性内切核酸酶可识别长度为4～7bp的双链DNA特定序列，该识别序列(识别位点)常呈旋转对称性 ② 切割方式 平齐末端 、5’—磷酸端2～5个核苷酸突出单链黏性末端 、3’-羟基端2～5个核苷酸突出单链黏性末端 ; ;③ 同裂酶与同尾酶 isoschizomer ：在Ⅱ型限制性内切核酸酶中，来源不同而识别序列和切割方式均相同者 如：HpaⅡ和Msp I两者的识别序列都是CCGG，切割方式也相同，因此二者为同裂酶 isocaudamer ：来源及识别序列不同，但DNA经其切割后能形成相同黏性末端者 如：BamH I、Bcl I、BglⅡ、Mbo I、Sau3A I及XhoⅡ切割DNA后都形成相同的GATC四核苷酸突出单链黏性末端，因此其为一组同尾酶 需要指出的是，由同尾酶切割DNA所得到的黏性末端可以彼此连接起来，但是不能重新切开，即原来同尾酶的识别序列都已不再存在。;④ 限制性片段长度与切割频率 经限制性内切核酸酶切割后产生的DNA片段