第八章_微生物分子育种技术_修改.pptVIP

黑曲霉表达系统 自学 三、常用的工具酶 基因工程中的工具酶主要是指用于DNA和RNA分子的切割、连接、聚合、修饰、反转录等有关的各种酶系统。 限制性内切酶 连接酶 逆转录酶 DNA聚合酶 DNA酶 其他 是一类由细菌产生的能专一识别双链DNA中的特定碱基序列、并水解该点磷酸二酯键 的核酸内切酶，简称限制酶或切割酶。 根据限制酶的作用特性，一般分为三类： ——Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型， 其中常用的是Ⅱ型限制酶。 （一）、限制性核酸内切酶(RE) 特异识别及切割4?8个bp长度且具有回文序列的DNA片断,主要产生3种缺口： 5’－粘性末端 3’－粘性末端 平端或钝端 回文序列 是指该部位的核苷酸序列呈180O旋转对称; 粘性末端 是指经内切酶特异切割后产生的5’-末端突出或3’-末端突出的碱基序列相互具有互补性。 限制酶（Ⅱ型）识别及切割位点 ⑴ 产生5-粘性末端 ⑵ 产生3-粘性末端 ⑶产生平(头末)端/钝端 其它特殊性质的Ⅱ型限制酶 同裂酶（异源同工酶） 同尾酶 可变酶 同裂酶 同裂酶又称异源同工酶。指来源不同，但具有相同的 识别序列。 在切割DNA时， (1)切割点可以是相同的，产生平头末端，称为同识同切； (2)切割点也可以是不同的，产生3’或5’粘性末端，称为同识异切。 同裂酶——同识同切 同裂酶——同识异切 同 尾 酶 同尾酶是指来源不同，但识别与切割顺序有一定的 相关性的一类酶。它们作用后产生相同的粘性末端。 可变酶 可变酶 识别顺序中的一个或几个碱基是可变 的，并且识别顺序往往超过6个碱基对。 如BstpⅠ，其识别顺序为GGTNACC。 常用限制性核酸内切酶的特性 微生物名称 酶名称 识别顺序 同裂酶 同尾酶 Bacillus amyloliquefaciens H 解淀粉芽孢杆菌 BamHⅠ GGATCC BstⅠ Bgl Ⅱ MboⅠ Bacillius globigil 球芽孢杆菌 Bgl Ⅱ ACATCT Escherichia coli RY13 大肠杆菌 EcoRⅠ GAATTC Haemophilus influenzae 流感嗜血菌 Hind Ⅲ AAGCTT HsuⅠ Providencia stuartii 164 普罗威登细菌 PstⅠ CTGCAG SalpⅠ Streptomyces albus Subspecies pathocidicus 白色链球菌 SalⅠ GTCGAC AvaⅠ XhoⅠ (二)、DNA聚合酶 最常用的DNA聚合酶有以下4种 DNA聚合酶Ⅰ DNA聚合酶Ⅰ大片段——Klenow片段 Taq DNA聚合酶 T4 噬菌体DNA聚合酶 (I)DNA聚合酶Ⅰ E.Coli DNA聚合酶Ⅰ（DNA pol Ⅰ）是一 个具有3 种酶活性的多功能性酶。 包括： 5’→3’DNA 聚合酶活性 5’→3’核酸外切酶活性 3’→5’核酸外切酶活性 DNA 聚合酶I 的应用 ⑴ 催化DNA缺口平移反应，制备高比活性DNA 探针； ⑵ 第二条cDNA链的合成； ⑶ 对DNA3’突出末端进行标记； ⑷ DNA序列分析。 E. coli DNA pol. Ⅰ催化切口平移 （Ⅱ）Klenow片段（DNA pol.大片断） Klenow片段用途 ⑴ 补齐双链 DNA的3ˊ末端； ⑵ 用标记碱基 补齐3ˊ末端 ； ⑶ 在cDNA克隆中，用于第二股链的合成； ⑷ DNA序列分析。 (Ⅲ)Taq DNA pol（耐热DNA聚合酶） 作用特点 (1) Taq DNA pol催化DNA合成的最适温度 范围70?75℃; (2)95℃以上高温，半小时不失活; (3)最适合用于聚合酶链反应（PCR）。 (三)、逆转录酶 特点: 逆转录酶是一个多功能性酶，至少具有以 下3种酶活性： ⑴ 以单链RNA为模板，催化合成cDNA单链； ⑵ 具有RNaseH 活性，能水解RNA:DNA杂交链 中的RNA； ⑶ 以DNA为模板，催化合成cDNA双链。 ⑴ 将mRNA逆转录成cDNA，构建cDNA文库； ⑵ 补平和标记5’-末端突出的DNA片段； ⑶ 代替Klenow酶用于DNA序列分析； ⑷ 制备杂交探针等。 逆转录酶的应用： (四)、DNA连接酶(DNA ligase) DNA连接酶可以催化带有粘性末端