3-2基因工程制药.ppt

第四节 基因表达 选择原则： ① 容易获得较高浓度的细胞； ② 能利用易得廉价原料； ③ 不致病、不产生内毒素； ④ 发热量低，需氧低，适当的发酵温度和细胞形态； ⑤ 容易进行代谢调控； ⑥ 容易进行DNA技术操作； ⑦ 产物的产量、产率高，且易提取纯化。 ①原核细胞：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌等； ②真核细胞：酵母、丝状真菌、哺乳动物细胞。 1、原核细胞 （1）大肠杆菌：表达产物的形式：细胞内不溶性表达（包涵体）、胞内可溶性表达、细胞周质表达，极少还可分泌到胞外表达。不同的表达形式具有不同的表达水平，且会带来完全不同的杂质。 特点: A、大肠杆菌中的表达不存在信号肽，故产品多为胞内产物，提取时需破碎细胞，此时细胞质内其他蛋白也释放出来，因而造成提取困难。 B、由于分泌能力不足，真核蛋白质常形成不溶性的包涵体(inclusion body)，表达产物必须在下游处理过程中经过变性和复性处理才能恢复其生物活性。 C、在大肠杆菌中表达不存在翻译后修饰作用，故对蛋白质产物不能糖基化，因此，只适于表达不经糖基化等翻译后修饰仍具有生物功能的真核蛋白质，在应用上受到一定的限制。 由于翻译常从甲硫氨酸的AUG密码子开始，故目的蛋白质的N端常多余一个甲硫氨酸残基，容易引起免疫反应。大肠杆菌会产生很难除去的内毒素，还会产生蛋白酶而破坏目的蛋白质。 （2）枯草芽孢杆菌：分泌能力强，可将蛋白质产物直接分泌到培养液中，不形成包含体。该菌也不能使蛋白质糖基化，另外由于它有很强的胞外蛋白酶，会对产物进行不同程度的降解，因此，它的应用也受到限制。 （3）链霉菌：重要的工业微生物。特点是不致病、使用安全，分泌能力强，可将表达产物直接分泌到培养液中，具有糖基化能力，可做理想的受体菌。 2、真核细胞 （1）酵母：繁殖迅速，可廉价的大规模培养，而且没有毒性，基因工程操作与原核生物相似，表达产物直接分泌到细胞外，简化了分离纯化工艺。表达产物能糖基化。特别是某些在细菌系统中表达不良的真核基因，在酵母中表达良好。 （2）丝状真菌：很强的分泌能力；能正确进行翻译后加工，包括肽剪切和糖基化；而且糖基化方式与高等真核生物相似；丝状真菌（如曲霉）被确认是安全菌珠，有成熟的发酵和后处理工艺。 （3）哺乳动物细胞：由于外源基因的表达产物可由重组转化的细胞分泌到培养液中，培养液成分完全由人控制，从而是产物纯化变得容易。产物是糖基化的，接近或类似于天然产物。但动物细胞生产慢，生产率低，而且培养条件苛刻，费用高，培养液浓度较稀。 虽然从理论上讲，各种微生物都可以用于基因表达，但由于克隆载体、DNA导入方法以及遗传背景等方面的限制，目前使用最广泛的宿主菌仍然是大肠杆菌和酿酒酵母。 （一）表达载体 表达载体必需具备的条件； 问题:阻遏子repressor的阻遏作用对host cell有何影响？对foreign gene的表达有无影响？ 常用载体： PBV220系统 PET系统 （二）大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征 大肠杆菌表达外源基因的优势 全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架； 基因克隆表达系统成熟完善； 繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定； 被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物； E.coli基因组概况 E.coli的染色体为闭合双链环状DNA，长约1333um。 1997年测定完成E.coliK-12 MG1655菌株全基因组: 4,639，221（约4.7×106）bp 其中：87.8％编码蛋白质 0.8％编码稳定性RNA 0.7%无编码功能的重复序列 11％属调节序列和具有其它功能 在编码蛋白质序列：总共编码4405种已知和未知的蛋白质（可读框），其中约38％功能不明。 E.coli基因组概况 在K-12 MG1655菌株中，基因的平均长度为950bp,基因之间的平均间隔约为118bp，但是菌株之间可能会有很大的差别。 2005年报道了第二个菌株E.coliK-12 W3110基因组的完整序列。比较K-12 MG1655菌株和K-12 W3110菌株，发现两者基因组大小并不是一致的。 K-12 W3110基因组大小为4，646，332bp基因总数为4464个 K-12 W3110与K-12 MG1655两者相同的基因为4453个。 （二）大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征 大肠杆菌表达外源基因的劣势 缺乏对真核生物蛋白质的复性功能； 缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统； 内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白； 细胞周质内含有种类繁多的内毒素。 Trp操纵子的衰减调控 其他表达系统 启动子 终止子 核糖体结合位点 密码子 质粒拷贝数 启动子 启动子 启动子的保守序列 启动