蛋白质指纹图谱技术-标准化与重复性.pptVIP

蛋白质指纹图谱技术 标准化与重复性 姓 名：姜 伟 专 业：检验医学信息学 导 师：王开正 教授 泸医附属医院检验医学科 一、蛋白指纹图谱技术 表面增强激光解析电离飞行时间质谱(surface—enhanced laser desorption／inionation-time of flight-mass spectra，SELDI-TOF-MS) 优势指标： 待测样本来源广 样品用量极少 超高的检测灵敏度，可快速获取实验结果 可用于低丰度、小分子量蛋白质的发现 可发现与疾病相关蛋白，提供疾病诊断的最佳组合指标 可进行小型实验或高通量检测自由选择 二、应用范围 生物标志物的发现 肿瘤蛋白标志物：肺癌、胃癌、食道癌、肝癌、 大肠癌、乳腺癌、卵巢癌等 疾病标志蛋白：α-Defensin 1.2.3 、LGT蛋白质 组、心血管病、糖尿病、肾移植 蛋白质的纯化与鉴定 蛋白质-蛋白质相互作用 药物研发及药理学研究 三、待解决的问题 重复性:影响蛋白标志物的确证和应用 样本收集 复杂的实验条件 操作的高度精密性 仪器和芯片的稳定性 结果偏差在解释上的混乱 受众多因素的影响 标准化 实验条件 实验过程（样本处理、芯片结合、芯片检测） 操作 仪器和芯片 分析方法和软件 质量控制 四、重复性与标准化 四、重复性与标准化 （一）实验条件 芯片的选择：CM10、Q10、H4、H50、IMAC3、 PS10/PS20/RS100 芯片列表 试剂及稳定性：国产和Sigma试剂 裂解液 HPLC纯度级或Milli Q H2O 能量吸收分子（EAM）：SPA50%、CHCA35% TFA ■ 缓冲液:Binding Buffer Neutralization Buffer  Washing Buffer NaAc Buffer■ 实验温度:蛋白变性、芯片活化、样品与芯片  的结合（4℃ 层析柜）■ 孵育时间：芯片的选择 （二）仪器的校正 激光强度 打击的准确性 仪器的稳定性 蛋白分子量进行矫正：All-in-one芯片 insulin 芯片调教仪器解析度 （三）参数设置 激光强度 检测灵敏度 检测范围 优化范围 打击位置（20-24；80-84） 预热位置 信噪比（S/N） （四）数据处理 ■ 降低基线 ■ Normalize ■ 均一化 不同组的多个样本比较蛋白质峰表达的 差异前必须将实验中产生的分子量和强度的 误差加以校正： （四）软件分析 决策树判别分析模型 人工神经网络模型（ANN） 遗传算法结合支持向量机模型（SUM） 联合学和优化方法学数据逻辑分析（LAD）策略 浙江大学肿瘤研究所： 蛋白质谱数据分子平台（ZUCI-PDAS） 相关系数矩阵分析 （五）对照血清 调整仪器使其图谱稳定： 使几个高表达的蛋白峰的强度和解析度都在可接受范围内，以比较实验的重复性（试剂、操作、仪器的稳定性）。 方法： 混合血清 标准血清芯片 （六）质量控制 分析前的质量控制 □ 样本的收集和制备 □ 实验试剂的选择、保存、使用范围： 反应试剂 质控品 标准蛋白 □ 实验仪器的维护与校正 实验过程中的质量控制 □ 基质效应：排除M/Z:2000以前的蛋白质峰 □ 噪音影响：去除噪音 后续数据分析的标准化 □ 分析数据性质 □ 数据分析方法的选择 HUPO：蛋白质组学数据描述系统 严格的多中心和三期临床质控验证 * * 生物化学芯片流程图 蛋白质芯片 单克隆抗体 抗体芯片 抗原抗体复合体 抗体固定 用SELDI检测捕获的抗原 抗原捕捉 清 洗 结合能量吸附物质 NaAc Buffer Peptides Proteins Y Detector Laser (+) (+) (+) ---- Vacuum ---- (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) Accelerating Potential + - 0 2.5 5 7.5 Spectra View 2000 4