jiaoan31第三章研究方法1.pptVIP

?细胞形态结构的观察方法 ?细胞组分的分析方法 ?细胞培养、细胞工程与显微操作技术 一 细胞形态结构的观察方法 ?光学显微镜技术（light microscopy） ?电子显微镜技术 (Electro microscopy) ? 扫描遂道显微镜 (scanning tunneling micros-cope, STM ) 二 细胞组分的分析方法 ?离心分离技术 ?细胞内核酸、蛋白质、酶、糖与脂类等的显示方法 ?特异蛋白抗原的定位与定性 ?细胞内特异核酸的定位与定性 ?放射自显影技术 ?定量细胞化学分析技术 三 细胞培养、细胞工程与显微操作技术 ?细胞的培养 ?细胞工程 0.61λ D= —————— N·Sin α/2 第一节 细胞形态结构观察技术 1.普通光学显微镜：单细胞生物体或体外培养细胞 2.紫外光显微镜：胶体颗粒，测定细胞核中的核酸含量 3. 暗视野显微镜：细胞器，如核、线粒体 4 . 相差显微镜：活细胞，研究细胞器的动态 5.微分干涉差显微镜：观察活细胞中的颗粒及细胞器的运动 6. 荧光显微镜：显示不同（蛋白）成分在细胞中的定位 7.激光共聚焦显微镜：亚细胞结构与组分的定位及动态变化 以锇酸和戊二醛 固定样品，以环 氧树脂包埋，以 热膨胀或螺旋推 进的方式推进样 品切片，切片厚 度20~50nm，切片 采用重金属盐染 色，以增大黑白 反差。 用重金属盐（如磷钨酸、醋酸双氧铀）对铺展在载网上的样品进行染色；吸去染料，样品干燥后，样品凹陷处铺了一薄层重金属盐，而凸出处则没有染料沉积，从而出现负染效果，分辨力可达1.5nm左右。 二、 细胞内核酸、蛋白质、 酶、糖与脂类等的显示方法 ?原理：利用一些显色剂与所检测物质中一些 特殊基团特异性结合的特征，通过显 色剂在细胞中的定位及颜色的深浅来 判断某种物质在细胞中的分布和含量。 三、特异蛋白抗原的定位与定性 ?免疫荧光技术： 快速、灵敏、有特异性，但其分辨率有限 （图） ?蛋白电泳(SDS) 与免疫印迹反应(Western-Blot) 四、细胞内特异核酸的定位与定性 ?光镜水平的原位杂交技术 （同位素标记或荧光素标记的探针） ?电镜水平的原位杂交技术 （生物素标记的探针与抗生物素抗体相连的胶体金标记结合） 　　　　　　 ?PCR技术 PCR技术 五、放射自显影技术 ?原理及应用： ?利用同位素的放射自显影，对细胞内生物大分子进行定性、定位与半定量研究； ?实现对细胞内生物大分子进行动态和追踪研究。 ?步骤： ?前体物掺入细胞（标记：持续标记和脉冲标记） ———放射自显影 六．定量细胞化学分析技术 ? 细胞显微分光光度术（Microspectroph-otometry） 根据细胞成分所具有的这种特性，可利用细胞分光光度计(cytospectrophotometer)对一定的成分（如核酸与蛋白质等）进行定位、定性，甚至定量测定。 包括： 紫外光显微分光光度测定法 可见光显微分光光度测定法 ? 流式细胞仪（Flow Cytometry） ?主要应用： 用于定量测定细胞中的DNA、RNA或某一特异蛋白的含量； 测定细胞群体中不同时相细胞的数量； 从细胞群体中分离某些特异染色的细胞； 分离DNA含量不同的中期染色体。 放射自显影的切片用染料染色后，便可在显微镜下对标记上放射性的化合物进行定位或定量测定。 细胞中有一些成分具有特定的吸收光谱，核酸(260nm)、蛋白质(280nm)、细胞色素、维生素等都有自己特征性的吸收曲线。有的成分经组织化学染色后，对可见光有特定的吸收光谱。 流式细胞分选术 (fluorescence-associated cell sorting, FACS) 激光 细胞悬液 鞘液 液滴加电信号 探测器 超声波振摇器 加负电的液滴 加正电的液滴 细胞收集容器 细胞收集容器 废液容器（未探测细胞） 由于电子束不能透过玻璃，因此用于电镜的标本须制成厚度仅有0.05?m的超薄切片，并放在铜网上。这种切片需要用超薄切片机 制作。电子显微镜的放大倍 数最高可达近百万倍。 1. 超薄切片技术 二、主要电镜制作技术： 超薄切片 铜网 示肌动蛋白纤维 2. 负染色技术 亦称冰冻断裂(freeze-fracture)，是研究生物膜内部结构的一种有用的技术