植物组织培养第三次课.pptVIP

第一章 实验室及基本操作 第三节 培养基 一、培养基的构成 培养基有两种：固体培养基和液体培养基，区别在于是否加入凝固剂 （一）水分 在研究上，常用蒸馏水来配制培养基，而最为理想的水应该是纯水，在生产上，为降低成本，有时可用高质量的自来水代替蒸馏水。 （二）无机盐类 大量元素：N、P、K、Ca、Mg、Na、Cl、S 使用浓度：1-3mmol/L N元素：硝态氮和氨态氮 NH4NO3、KNO3 P元素：以PO43-为主 能量的贮存、转化、核酸、蛋白质及细胞膜的主要成分 K：细胞渗透压调节剂，对胡萝卜不定胚的分化有作用 微量元素：Fe、Mn、Cu、Zn、B、Co、Mo 使用浓度：10-7～10-5 mol/L 微量元素是酶和辅酶的主要成分，直接影响蛋白质的活性，Fe是叶绿素的重要成分，没有Fe，组织会产生黄化和死亡现象，Fe通常以FeSO4和Na2-EDTA螯合物的形式添加，否则出现沉淀 （三）有机营养成分 1、糖类物质 常用有蔗糖、葡萄糖、果糖、麦芽糖等，蔗糖浓度范围10-50g/L 作用：幼小外植体的碳源和能源，调节培养基渗透压 2、维生素类 常用维生素VB1、VB6、VB12、VB5（烟酸）、VC和生物素，0.1-1mg/L 作用：对愈伤组织和器官形成有促进作用，VC有防止褐化的作用 肌醇：提高VB1的效果，促进愈伤组织、不定芽、不定胚分化，50-100 mg/L 3、氨基酸类 常用甘氨酸、丝氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、天门冬酰胺 作用：提供N源，促进外植体的生长及不定芽、不定胚的分化，1-3 mg/L （四）植物生长调节剂 1、生长素（使用浓度10-7～10-5 mol/L） 生长素由茎尖合成，沿植物体向下运输，有促进细胞生长和生根的作用 常用：IAA、NAA、2，4-D、IBA 生长素在愈伤组织形成和生根方面起着重要作用，2，4-D还会诱导不定胚的形成，高浓度的生长素对芽的形成有抑制作用。 2、细胞分裂素（使用浓度10-7～10-5 mol/L） 由根尖合成向上运输，主要作用是促进细胞分裂和器官分化，促进侧芽分化和生长，抑制顶端优势，在组培中，促进细胞分裂，诱导愈伤组织、不定芽和不定胚的产生 常用：KT、ZT、6-BA、TDZ 高浓度的细胞分裂素对生根有抑制作用 3、赤霉素 促进器官形成 4、脱落酸（ABA）抑制生长，促进休眠，常用于植物种质资源的超低温冷冻保存 （五）天然有机添加物质 含有有机营养成分的生理活性物质，通常过滤除菌 （六）pH 灭菌前5.0-6.0，常用5.7-5.8，如果pH值过高，培养基会变硬，过低影响培养基的凝固，常用NaOH或HCl进行调整（1.0 mol/L、0.1 mol/L） （七）凝固剂 琼脂：7-10g/L 当培养基的pH低或琼脂纯度不高时，应适当增加用量，灭菌时间过长或温度过大也会影响琼脂的凝固 （八）其他添加物 防止褐化：活性碳、VC 抑菌：抗生素 二、培养基的选择 （一）培养基的基本类型 1、含盐量较高的培养基 2、KNO3含量较高的培养基 3、中等无机盐含量的培养基 4、低无机盐含量的培养基 （二）基本培养基的选择 MS培养基无机盐类浓度较高，尤其是铵盐和硝酸盐，能够满足快速增长的植物细胞对营养元素的要求，但不适合生长缓慢，对无机盐类浓度要求比较低的植物，尤其是不适合铵盐过高易发生毒害的植物 三、培养基的配制 （一）培养基母液的配制 1、基本培养基母液 通常母液的浓度是培养基浓度的10倍、100倍或更高，以MS培养基母液的配制为例 2、植物生长调节剂母液 浓度：1-10mmol/L 配制：IAA、IBA、ZT、2，4-D，GA3 95%酒精，用水定容 NAA热水、95%酒精，用水定容 KT、6-BA1mo l/L HCl，水定容 （二）培养基的配制 具体步骤： 1、取出母液、量筒、烧杯、移液枪、玻璃棒等按顺序放好 2、取一只烧杯，加1/3纯水，按顺序加入母液，并不断搅拌 3、加入植物生长调节剂和蔗糖 4、加入琼脂，并加热使其完全溶解 5、定容，调pH 6、分装、封口 7、灭菌 8、取出、冷却凝固 第四节 离体培养体系的建立 一、供体植物材料 如何控制杂菌污染是初代培养的关键所在，植物材料的来源、取材部位和时期不同，污染情况各异。 （一）田间材料 性状优良，抗逆性强、品色俱佳的优良品质 （二）温室材料 （三）无菌发芽材料 具体做法：种子消毒，准备无菌培养皿、滤纸、无菌水 培养消毒种子 待发芽成苗后取材 二、外植体的选择和处理 （一）外植体的选择原则 1、再生能力强 为分化或分化程度较低的组织生长旺盛时取材，内源激素含量高，在分化比较容易 2、遗传稳定性好 3、外植体来源丰富 4、外植体灭菌容易 （二）常用的外植体 1、茎