植物组织培养第九次课.pptVIP

第七章 植物原生质体培养 （一）沉降法又称过滤离心法，该方法利用比重原理，低速离心使原生质体沉于底部。 （三）不连续梯度离心优点：获得的原生质体大小均匀一致，纯度高。缺点：操作繁杂，原生质体的收率低 （三）形态观察法 形态特征：颜色鲜艳，形态完整，富含细胞质则有活力。 渗透变化法：把原生质体放入高渗或低渗溶液中，观察涨缩情况来判断其活力。如果体积能随溶液渗透压的变化而改变，即为活的原生质体。 四、影响原生质体数量和活力的因素 （一）供试材料 （二）酶的种类、组合和降解时间 （三）渗透压稳定剂 （四）质膜稳定剂 （五）pH值 第二节 植物原生质体培养 一、原生质体培养方法 原生质体培养是指对分离出的原生质体进培养，使其分离分化直至形成完整植株的技术。 （一）平板培养法 （二）液体浅层培养法 （三）固液结合培养法 二、影响原生质体培养的因素 （一）原生质体的活力 （二）原生质体起始密度 （三）渗透压稳定剂 甘露醇、蔗糖、葡萄糖 （四）培养基成分 1.基本培养基 2.碳源 3.无机盐浓度和氮的形态 4.植物生长调节剂的浓度配比 （五）培养条件 1.光源 2.温度 26±1℃ （六）植物材料和基因型 三、原生质体再生 （一）细胞壁再生 1.细胞壁再生 2.影响细胞壁再生的因素 植物基因型种类、供体细胞的分化状况以及培养基成分等。 3.再生细胞壁的鉴定 荧光染色法。荧光素为卡氏白，如果有细胞壁存在，能观察到蓝色荧光，如果原生质体含有叶绿素，则能看到红色荧光，可用滤光片除去红光。 （二）细胞分裂和愈伤组织或胚状体形成 1.再生细胞的分裂和愈伤组织或胚状体形成 （1）细胞分裂 （2）愈伤组织或胚状体形成 分裂细胞持续分裂可能形成愈伤组织，也可能形成胚状体。 （3）植株再生 原生质体来源的细胞，其器官发生有两条途径：一是通过愈伤组织形成不定芽；另一途径是由原生质体再生细胞直接形成胚状体，由胚状体发育成完整植株。 （一）融合原理 1.化学法融合原理 带有阴离子的PEG（聚乙二醇）分子等与原生质体表面的阴离子之间在Ca2+连接下形成共同的静电键，从而促进了原生质体间的黏着和结合，在高Ca2+-高pH溶液的处理下，Ca2+和与质膜结合的PEJ分子被洗脱，导致电荷平衡失调并重新分配，使原生质体的某些阳电荷与另一些原生质体的阴电荷连接起来，吸附聚合，最后融合在一起。 2.物理法融合原理 对融合槽的两个平行电极施加高频交流电压，产生电泳效应，使融合槽内的原生质体偶极化并沿着电场的方向排列成串珠状。，再施加瞬间的高压直流脉冲，使黏合相邻的原生质体膜局部发生可逆性瞬间穿孔，然后，原生质体膜连接，闭合，最后融合为一体。 （二）融合类型和方法 1.融合类型 （1）对称融合 通过物理方法或化学方法，使种内或种间完整原生质体融合，产生核与核，胞质与胞质间重组的对称杂种的技术。 亲缘关系较远的种、属间植物，经对称融合产生的杂种细胞在发育过程中，由于分裂的不同步等原因，常发生一方亲本的染色体部分或全部丢失，而产生不对称杂种。 原生质体融合后的个体称为融合体，同种原生质体间的融合称为同源融合，该融合体称为同核体。非同种原生质体间的融合称为异源融合，该融合体称为异核体。 （2）不对称融合 通过物理或化学方法处理亲本原生质体，使一方细胞核失活，或同时使另一方细胞质基因组失活，再进行原生质体融合，获得只有一方亲本核基因的不对称杂种的技术。 无核的亚原生质体称为胞质体，有核的小原生质体或只有核和原生质体膜构成的亚原生质体称为核质体。 对称融合技术在实现双核优良性状重组的同时，无法排除不良性状，也不能单独利用一方的核基因或胞质基因。而不对称融合技术能够通过物理方法（如X射线、γ射线、紫外线照射）或化学方法处理原生质体，使其细胞核失活或不能正常分裂，细胞质基因组正常，来培育不对称杂种。 辐射处理可能产生诱变效应，化学物质对原生质体有伤害，注意剂量不要过高。 （3）微原生质体融合 微原生质体融合又称为微核技术（micronucleus technology），是指植物细胞经微核化处理后形成的外包有被膜，内含一条或几条染色体的微核作为供体，与受体原生质体融合，从而实现部分基因组转移的技术。 应用：微原生质体融合技术是近年来开发的一项新技术，可克服生殖隔离，转移多基因性状或未知基因性状，获得单体或二倍体附加系，建立特异染色体DNA文库以及研究外源基因的功能等。 2.融合的方法 ?自发融合（Spontaneous Fusion）：在溶解细胞壁过程中，有些原生质体能彼此融合形成同核体。 ?诱导融合（induced fusion）：用物理或化学的方法来诱导原生质体的融合。步骤：两个或多个原生质体的质膜彼此靠近，局部区