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2 纯培养技术和显微技术 2.1 纯培养技术 一. 无菌技术 二. 用固体培养基分离纯培养 三. 用液体培养基分离纯培养 四. 单细胞（孢子）分离 五. 选择培养分离 六. 二元培养物 七. 微生物的保藏技术 2.2 显微技术 一. 显微镜种类及其原理 二. 显微观察样品的制备 微生物的基本特点：小！ 在绝大多数情况下都是利用微生物的群体来研究其属性； 微生物的物种（菌株）一般也是以群体的形式进行繁衍、保存； 培养技术在微生物学中具有重要意义！ 在研究中所使用的微生物培养群体： 培养物：在一定的条件下培养、繁殖得到的微生物群体 混合培养物：含有多种微生物的培养物；纯培养物：只有一种微生物的培养物； 只有纯培养物才能提供单一微生物种的性状,纯培养技术是进行微生物学研究的基础！ 保证纯培养的无菌技术是保证微生物学研究正常进行的关键！ 微生物的基本特点：小！ 决定了显微技术是进行微生物研究的另一项重要技术，因为绝大多数微生物的个体形态及其内部结构只能通过显微镜才能进行观察和研究。 2.1 纯培养技术 一. 无菌技术 在分离、转接及培养纯培养物时防止其被其他微生物污染的技术被称为无菌技术 灭菌： 用于分离、培养微生物的器具事先不含任何微生物； 无菌操作：在转接、培养微生物时防止其它微生物的污染； 1、微生物培养的常用器具及其灭菌 常用的器具：试管、瓶子、培养皿等 常用的灭菌方法：高压蒸汽灭菌115℃ 30 min，121 ℃ 20 min; 高温干热灭菌160℃ 2 h，140℃ 4h；过滤除菌。 2、无菌操作 火焰附近（酒精灯、煤气灯）进行；在无菌箱或操作室内无菌的环境下进行 二. 用固体培养基分离纯培养 几个基本概念: 菌落（colony）:单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体。 菌苔（lawn）:当固体培养基表面众多菌落连成一片时，便成菌苔。 平板，即培养平板（culture plate）：指固体培养基倒入无菌平皿，冷却凝固后，盛固体培养基的平皿。 不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落或菌苔一般都具有稳定的特征（形状、颜色等），可以成为对该微生物进行分类、鉴定的重要依据。 同一细菌在不同的培养平板上形成不同的特征菌落 培养基：液体培养基；固体培养基；半固体培养基 稀释倒平板法（pour plate method） 涂布平板法（spread plate method） 平板划线法（streak plate method） 4. 厌氧微生物的分离纯培养: 稀释摇管法（dilution shake culture method）; 自制简易装置; 厌氧罐; 厌氧手套箱 三. 用液体培养基分离纯培养 顺序稀释，高度稀释，使一支试管中分配不到一个微生物。采用稀释法进行液体分离，必须在同一个稀释度的许多平行试管中，大多数（一般应超过95%）表现为不生长。 分离出混杂微生物群体中占数量优势的种类 四. 单细胞（孢子）分离 用显微操作仪，在显微镜下进行。难度与细胞或个体的大小成反比，限于高度专业化的科学研究中采用。 五. 选择培养分离 没有一种培养基或一种培养条件能够满足自然界中一切生物生长的要求，在一定程度上所有的培养基都是选择性的。 自然样品中，某一种微生物所存在的数量与其它微生物相比非常少时，单采用一般的平板稀释方法几乎是不可能分离到该种微生物的。 例:若某处的土壤中的微生物数量在108时，必须稀释到10-6才有可能在平板上分离到单菌落，而如果所需的微生物的数量仅为102~3，显然不可能在一般通用的平板上得到该微生物的单菌落。 选择平板：抑制使大多数微生物不能生长，或具区别特征的直观结果。 富集培养：造成有利于某种菌生长的环境 1. 利用选择平板进行直接分离 高温下培养：分离嗜热细菌；培养基中不含N：分离固氮菌；培养基加抗生素：分离抗性菌； 待分离的微生物生长，其它微生物的生长被抑制 牛奶平板：分离蛋白酶产生菌； 待分离的微生物的生长特征明显不同于其它微生物(X-gal，5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷,蓝白斑) 2. 富集培养 利用不同微生物间生命活动特点的不同，制定特定的环境条件，使仅适应于该条件的微生物旺盛生长，从而使其在群落中的数量大大增加，人们能够更容易地从自然界中分离到所需的特定微生物。 六. 二元培养物 培养物中只含有二种微生物，而且是有意识的保持二者之间的特定关系的培养物称为二元培养物。病毒和宿主细胞；寄生细菌和细菌; 纤毛虫、变形虫或细菌菌体细胞和粘细菌； 七. 微生物的保藏技术 性状稳定的菌种是微生物学工作最重要的基本要求，否则生产或科研