第四章 细胞培养(笔记).pptVIP

* * * * * * * * * * * * * * * * * 二、悬浮培养类型和方法 第二节 细胞悬浮培养 成批培养 连续培养 * （一）、成批培养 1. 概念：是指细胞接种在一定容积培养基的密封系统中培养，当培养基中主要营养成分耗尽时，细胞即停止生长，完成培养过程的方法。含义：将细胞培养在一定容积的密闭容器中进行培养。 第二节 细胞悬浮培养 * 2. 成批培养的特点 ①培养系统密闭 ②培养基体积固定，当其中的主要营养物质耗尽时，细胞即停止生长，因此，丛开始培养一定起始密度的细胞到细胞停止生长这一过程称为一个培养周期。 ③细胞数目、总重量、DNA含量变化，呈一个“S”型曲线。 第二节 细胞悬浮培养 * 培养时间 培养细胞数目 1 2 3 4 5 延迟期 对数生长期 直线生长期 缓慢期 静止期 1 2 3 4 5 第二节 细胞悬浮培养 细胞生长“S”型曲线 * “S”型曲线 延迟期：细胞较少分裂，其长短与接种量大小和继代时原种细胞所处的生长期有关。 对数生长期：细胞进入活跃分裂、数目迅速增加的状态； 减缓期：细胞分裂逐渐减慢，营养消耗将尽，有毒代谢物质增多，氧气减少。 静止期：细胞生长几乎停止，数目极少增加，甚至开始死亡。 第二节 细胞悬浮培养 * 成批培养的特点 ④为使成批培养细胞不断增殖，必须在悬浮培养液达最大重量时尽快进行继代培养，使细胞一直保持对数生长。 ⑤ 需搅拌，以使游离细胞和小细胞团在培养基中均匀分布。 总之：成批培养中细胞生长和代谢方式以及培养基成分在不断改变，没有一个稳定的细胞生长期，细胞代谢物和酶浓度不能恒定。 第二节 细胞悬浮培养 * 3. 成批培养的方法 (1)旋转培养 (2)往返震荡培养 (3)旋转震荡培养 (4)搅动培养 第二节 细胞悬浮培养 * （二）、连续培养（Continuous culture） 第二节 细胞悬浮培养 含义：指在培养过程中，以不断排出悬浮培养物并注入等量新鲜培养基，使培养物不断得到养分补充，保持其恒定体积的培养。 * 连续培养示意图 第二节 细胞悬浮培养 * 1、连续培养的特点： （1）新鲜培养基的不断加入,保证了养分的充分供应，可使细胞保持在增殖旺盛的对数生长期中；（2）通过调节流入与流出培养液速度可使培养细胞生长速率相对一致，形成一个稳定的培养状态；（3）适于大规模工业化生产 第二节 细胞悬浮培养 * (1)半连续培养：每隔一定时间倒出一定量的悬浮液，同时补充加入等量的新鲜培养液 (2)连续培养： 开放式和封闭式 第二节 细胞悬浮培养 2、连续培养的种类： * 开放式连续培养： 细胞随排出液一起流出，且速度恒定。在稳定状态下，流出的细胞速率等于培养系统中新细胞的增长速率。 开放式连续培养系统中保持细胞恒定的方式分为浊度恒定法和化学恒定法。 第二节 细胞悬浮培养 * 用途更广泛的是开放式连续培养 浊度恒定法：即选定一种细胞密度，定量测定培养液中的细胞混浊度，通过控制培养液流入量使悬浮培养浊度恒定。 化学恒定法：是将新鲜培养基的某一种营养液或营养成分调节为生长限制因子浓度，并以恒定速率输入，从而使细胞增殖保持在一种稳定状态中。 第二节 细胞悬浮培养 * 封闭式连续培养： 细胞随排出液流出后再用机械方法收集起来，放入原培养系统中，故培养系统中细胞数量在不断增加。 第二节 细胞悬浮培养 * 第三节 单细胞培养 第三节 单细胞培养 * 单细胞培养常用的方法： 单细胞培养方法 看护培养法 微室培养法 固体平板培养法 液体浅层培养法 第三节 单细胞培养 * （一）、看护培养法（Nurse culture） 用途：诱导形成单细胞系。 第三节 单细胞培养 含义：指用一块活跃生长的愈伤组织来看护单个细胞，并使其生长和增殖的方法。 1 看护培养的含义及用途 * 看护培养图示： Nurse callus Filter paper Single cell 单细胞无性系 恒温培养1个月 2~3月 用一块活跃生长的愈伤组织来看护单个细胞，并使 其生长和增殖。这个愈伤组织称块为看护愈伤组织 第三节 单细胞培养 * 2 看护培养基本技术 （1）在一个培养瓶中加入一定量厚的固体培养基，灭菌后备用。 （2）在无菌条件下，将一小块（1cm3）活跃生长的愈伤组织接种到培养基上，再在愈伤组织块上放一片（1cm2）已灭菌的滤纸，放置一晚上。 （3）将分离的单细胞接种到培养基的滤纸上。 （4）恒温培养。 第三节 单细胞培养 * 优点：（1）简便易行。（2）效果好，易于成功。缺点：（1）不能在显微镜下直接观察细胞的生长过程。 第三节 单细胞培养 3、看护培养特点：