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蛋白质组学与分析技术（第四讲） 高效液相色谱、气相色谱、质谱 液质联仪 邱德文 中国农科院植物保护研究所 2007。3。28 蛋白质层析分离纯化技术 蛋白质薄层层析（硅胶板+层析缸） 蛋白质柱层析（葡聚糖、硅胶填料） 蛋白质分析制备仪 蛋白质分析制备仪 准备工作 考虑: 纯度水平 需要量 保持生物活性 有效和经济 蛋白质特性: 稳定性 - pH - 离子强度 - 温度 分子量 等电点 三步纯化策略 粗提 目的 纯化粗样 快速浓缩 (减少体积) 和稳定样品 (去除蛋白酶) 最适用层析技术: 离子交换 / 疏水层析 中度纯化 目的 去除大部分杂质 最适用层析技术: 离子交换 / 疏水层析 中度纯化: 离子交换填料 中度纯化:疏水层析填料 精细纯化 目的 达到最终纯度 (去除聚合物,结构变异物) 最适用层析技术: 凝焦过滤/离子交换 / 疏水层析/反相层析 色谱、质谱分析技术及蛋白质组学 色谱发展的历史 1906年:俄国植物学家M.S.Tswett 从一根装有固定吸附剂柱子的顶端注入植物色素的试样溶液,后使一种溶剂流过柱子,这时各个组分以不同的速度在柱内移动. 1.高效液相色谱 色谱原理： 色谱是一个分离的过程，在不同组分在固定相和流动相中，利用吸附能力、分配系数、离子交换能力、亲和力或分子大小等性质的微小差别，经过连续的多次在两相间的质量交换，使不同组分得到分离。 高效液相色谱系统 高效液相色谱的仪器组成： 1.高效液相色谱泵 可做梯度（四元梯度，waters），灵敏度高（MS泵，几个ul） 2.自动进样器 3.色谱柱、柱温箱 4.检测器 （紫外检测器PDA，荧光检测器，示差检测器） 5.组分收集器（无） 卓有成效的工作方法 1 首先估价样品与分离目的（切不可低估此步的重要性） 2设计开始的分离条件，使之有可能在一两次实验中，便可能得到有希望的色谱图。 3 预测可能发生的问题，当问题出现时，能用已知的办法解决。 卓有成效的工作方法 4 有限考虑试用最有希望的、能控制的分离方法。 5 应对每次实验进行设计，能提供有用信息。 6 HPLC的目的是分离，而不必使所需谱峰“过渡分离”。 样品的性质和预处理 可直接进样的样品溶液 需稀释缓冲pH或添加另一液体的溶液 能在流动相中溶解的固体 含有干扰物质或“损柱剂”而必须在进样前 将其去除的溶液 含有不容性赋性剂的混合物（动植物组织，高交联度聚合物、干性黏合剂） 绝大多数样品需经称重或稀释后进样，一般使最终样品液与流动相的成分尽量相近。 分离的基础：流动相的作用 要分离好的好，有两条途径：一是谱带窄，即柱效高；再就是谱带间距离大。 Rs=(t2-t1)/[(1/2(w1+w2)] t1，t2 为二相邻谱带间的保留时间，w1和w2为它们基线处的峰宽。Rs为其分离度。Rs≥1.5时 为完全分离。 当峰发生重叠时，难以准确测量到基线处的峰宽，更的办法好是用半高处的相应峰宽?1和?2： Rs= 1.18(t2-t1)/ (?1+?2) Rs≥1.25在一般情况下，能达到≥99％的分离度。 新柱的起始色谱图的Rs值越大，意味着该柱用此法时间越长。 Rs≤1.0时 定量分析一般精密度较差。 分离度与溶剂强度的关系 Rs=(1/4)(?-1)N0.5[k’/(1+k’)] k’代表了溶剂强度；?为分离因子；N为理论塔板数。 溶剂强度的增大，Rs增大，满意的范围1 k’20 在反相HPLC中溶剂强度会随着水/有机流动相中的有机相增加而增加。 柱类型与温度选择性的关系 柱类型不同，选择性业不一样，这与键和相有关。 温度的选择性，温度的变化会影响分离度，因为理解的程度与温度有关。 色谱柱与塔板数的关系 一般塔板数越大，分离度越好 合格的HPLC的塔板数，一般不应低于标准值的80％，否则为不合格。 色谱柱条件 流速适中，过高会降低塔板数。 当流动相粘度增加时，塔板数会降低， 对于反相体系，水的粘度较高意味着在高温时操作有利于最大限度的增大塔板数，在50度时较好。 其他因素 工作压力：低于150bar 操作时间：应尽可能短 峰高：只要检测灵敏度有限，需要窄而高的峰 溶剂应用：对日常工作、大量实验，每次进样少消耗流动相为好 色谱柱问题与解决办法 保留值与分离度的重现性 1选柱时，应考虑其化学性质 2在流动相中用缓冲剂，以除去化学的或硅羟基效应，尽量减少谱峰拖尾。 3保证温度、流速、和压力、溶剂成分恒定 4脱气 5保证上样不超载 1～10ug/mg填料。 6使用同一批生产批号的材料 谱峰拖尾 柱坏 污物在柱进口处堆积 样品超载 样品溶剂不合适 化学或次级保留效应 缓冲不足 重金属污染 系统方法的建立 1检测条件的选择 2梯度洗脱进行首次实验 3优化流动相的